环孢素对大鼠胰性脑病脑组织损害的保护作用

环孢素对大鼠胰性脑病脑组织损害的保护作用

重症急性胰腺（cp）疾病患者的病因有许多不同的机制，单因素不能全面解释。PE的发病并非单纯的胰酶变化所致,而更多的是与免疫异常有关。辅助T淋巴细胞(Th)1、2在介导机体免疫应答过程中扮演着不同的角色,检测PE病人的脑组织Th1和Th2类细胞因子(CK),有助于判断PE的发生发展和制定相应的治疗方案。环孢素(cyclosporineA,CsA)作为一种T淋巴细胞功能调节药,可以抑制包括T细胞生长因子(IL-2)在内的众多细胞因子的合成。本研究拟应用CsA作用于大鼠PE模型,观察其脑组织匀浆中代表Th1CK的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及代表Th2CK的白细胞介素-10(IL-10)的变化。探讨减轻SAP中所致的脑损害,从而达到阻断或减轻大鼠PE发生过程,现将结果报告如下。对照组,神经髓鞘结构蓝色变淡,髓鞘结构不连续,脱髓鞘。CsA治疗组,接近于正常神经髓鞘结构,神经髓鞘染为连续鲜蓝色结构。1材料和方法1.1动物造模制备Wistar雄性大白鼠60只,体重200～260g,雌雄不拘,随机分为对照组(n=30)CsA治疗组(n=30)两组大鼠。各组动物实验前12h禁食,自由饮水。参照苗毅等从颈内动脉注入PLA2复制大鼠PE模型。1%氯氨酮(1mL/100g)腹腔注射麻醉,由颈内动脉注入药物PLA2(0.1mL/100g,1000u/0.1mL。速度为0.05mL/min)制模。CsA治疗组在造模前5min腹腔注射CsA(30mg/kg),之后每天同时间腹腔注射CsA(30mg/kg),直至处死。对照组用等容积生理盐水代替。1.2鼠脑的切调查处死方法:1%氯氨酮(1mL/100g)腹腔注射麻醉后,腹主动脉放血处死。对照组和CsA治疗组分别于造模后1d、3d及7d各处死动物10只。取脑:十字切开鼠头皮肤,咬骨钳咬去颅骨,利用脑的自重下坠,剪去颅底神经,完整取下鼠脑。沿中线将鼠脑切开,右侧一半放入4%甲醛中固定保存,其中切取额叶少许白质放入4%戊二醛中固定保存。另一半垂直于中线的方向切成二份,额叶制备组织匀浆,枕叶用于测定脑组织的干湿重比。对照组,髓鞘的正常纹理不清,结构紊乱。髓鞘变形,厚薄不一,有的增生增厚,突向轴浆,有的松解、破碎,断裂呈多层状、空泡状、空网状改变,出现脱髓鞘化。CsA治疗组,尚可辨别髓鞘的致密板层结构,髓鞘变形、松解、破碎等改变轻微。1.3样品采集(1)脑水分析脑组织含水量=(湿重-干重)÷湿重×100%。(2)样品脑组织的均匀糊精制备按重量和冰蒸馏水体积的比(W/V)为1∶4制备20%的匀浆。(3)组织社会学检查脑组织额叶常规病理切片,髓鞘特殊染色,光镜及电镜下观察中枢神经系统的脱髓鞘改变。(4)砂罗铬花绿法髓鞘特殊染色,操作按说明书进行。(5)用il-10检测脑组织tnf-、il-10脑组织匀浆TNF-α,IL-10测定用双抗体夹心ELISA法测定,试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产,操作按说明书进行。1.4统计处理实验数据采用均值±标准差表示,各实验组数据采用SPSSl1.0软件作统计学处理。2结果2.1反射、反应迟轨道交通对照组大鼠表现为厌食,嗜睡,肌张力下降,活动减少,反应迟钝,抓捕反射减弱;CsA治疗组大鼠进食、活动、反应、抓捕反射均较对照组大鼠有不同程度改善。2.2两组脱髓冠朝情况比较砂罗铬花青法。对照组第1d脱髓鞘改变不明显,从第3d开始出现脱髓鞘改变,第7d最为明显。而CsA治疗组脱髓鞘改变轻微。图1为低倍光镜观察,图2为电镜观察。2.3各组大鼠脑tnf-和组织含水量比较(1)CsA治疗组大鼠脑组织IL-10水平表达均较对照组大鼠脑组织升高(P<0.05),对照组大鼠脑组织IL-10表达水平也升高,但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。CsA治疗组间比较:CsA治疗组间第3d,第7d与第1d比较均显著升高(P<0.01),与第3d比较,第7dIL-10水平表达显著升高(P<0.01)(见表1)。(2)CsA治疗组大鼠脑组织TNF-α水平表达均较对照组大鼠脑组织降低(P<0.05)。对照组大鼠脑组织TNF-α表达水平升高,但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。CsA治疗组间比较:CsA治疗组大鼠脑组织第3d,第7d与第1d比较均降低(P<0.05)、与第3d比较,第7d脑组织TNF-α水平表达显著降低(P<0.01)(见表2)。(3)CsA治疗组大鼠脑组织含水量较对照组大鼠脑组织含水量降低(P<0.05)。对照组大鼠脑组织含水量表达水平升高,但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。CsA治疗组间比较:CsA治疗组大鼠脑组织含水量第3d,第7d与第1d比较均降低(P<0.05)、与第3d比较,第7d脑组织含水量显著降低(P<0.01)(见表3)。3免疫抑制作用PE预防治疗的关键仍在于对原发病SAP的处理上,基于循证医学指导下的治疗策略的转变。随着SAP治疗结果的改善,PE的发病率和病死率明显下降。而AP本身的治疗也逐渐转移到全身的炎症反应上来。细胞因子和炎症反应失衡理论在SAP发病机制中的重要地位现已得到公认,炎症和抗炎反应的平衡使机体既能有效抵御致病因素的侵袭,又使炎症反应不至过于强烈而损伤机体器官正常功能。但在AP的情况下,这种平衡遭到破坏,炎症反应失控,CK大量释放,导致全身炎症反应,进而损伤多器官功能。这种失衡还表现为继发抗炎反应过度亢进,下调CK的产生,拮抗其作用,影响免疫细胞的功能,造成代偿性抗炎反应综合征(CARS)。Th1/Th2的变化能够反映机体促炎和抗炎反应的失衡状况。代表Th1的TNF-α在促炎因子中起核心作用,而代表Th2的IL-10是抗炎因子中的关键因子,目前认为TNF-α是导致胰腺及胰外器官组织释放其他炎症介质及CK的重要启动因子,它与AP的严重程度密切相关。TNF-α/IL-10的变化反映了Th1/Th2的功能变化,在AP病程中有由促炎反应向抗炎反应即免疫亢进向免疫抑制转化的趋势,反映了在ANP病程中有Th1向Th2漂移的倾向。CsA作为一种T淋巴细胞功能调节药,可特异性地抑制辅助性T淋巴细胞活性(Th);抑制T淋巴细胞分泌IL-2,对其他免疫细胞(如巨噬细胞、NK细胞、T细胞依赖性B细胞)的功能和细胞因子[如IL-4、IL-5、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、γ干扰素(IFN-γ)]等的分泌也有一定抑制作用。而对Th2型抑制性细胞因子IL-10,却能促进分泌。本实验中CsA治疗组脑组织匀浆TNF-α的水平较对照组明显下降,而IL-10则较对照组明显升高。因此,人为地促使Thl向Th2:转化,调整Thl/Th2的平衡可能是AP免疫干预治疗的措施之一,如果PE的自身免疫理论得到证实,那么,CsA强大的免疫抑制作用必将对PE的治疗提供一个新思路。众多研究表明,在细胞因子中,TNF-α是胰腺炎最早升高的细胞因子,起核心作用,TNF-α介导脑组织损害的作用机制可能与以下几个方面有关:(1)TNF-α可刺激PLA2的分化,也可直接激活PLA2;(2)TNF-α可激活白细胞并导致白细胞积聚,激活的白细胞可释放增强毛细血管通透性的炎性介质,炎性介质又可正反馈促进TNF一α等细胞因子产生,从而形成“瀑布”样级联反应;(3)TNF-α既可直接诱导血管内皮细胞的通透性增加,也可间接通过白细胞发挥作用;(4)TNF-α对血管内皮的黏附分子如ELAM—l和ICAM—l有向上调节作用,黏附分子向上调节可促进白细胞的黏附和收缩,造成毛细血管渗漏和组织损害;(5)TNF-α介导髓鞘的炎性损伤,刺激免疫细胞活化,造成对髓鞘的破坏,也可直接对髓鞘产生毒性破坏作用;(6)刺激血小板活化因子(PAF)生成,促使血小板聚集及释放反应,诱导脑微血管血栓形成及内皮细胞的破坏。IL-10具有抑制炎症维持细胞因子网络平衡的负调控作用已被众多学者所公认,由Th2细胞分泌,IL-10通过下调单核/巨噬细胞MHC-II类抗原的表达,不仅抑制经LPS激活下前炎症性细胞因子TNF-α的产生,并抑制了Thl细胞的活化及其IL-1β以及单核细胞等IL-6,IL-8的合成,且对LPS诱导下NO、血小板活化因子(PAF)等休克介质的产生也有下调作用,并证实IL-10具有对LPS败血症休克致死持久的抑制作用,能促使IL-1受体拮抗剂(IL-Ira)的表达,在体内外均证实具有抑制Thl介导的炎症反应。IL-10mRNA的合成又可通过IL-10自调作用被抑制,这在Th1/Th2的平衡调节中具有重要作用。因此,IL-10是维持细胞因子网络的负调节剂,并具有重要的临床治疗价值。CsA能选择性地抑制代表Th1的TNF-α,而对代表Th2的IL-10则有升高作用,促进SAP病程中Thl向Th2的漂移,从而促进AP的治愈。说明CsA可作为Th1向Th2转换的免疫调节剂,以拮抗Th1产生的前炎症性介质所介导的炎症作用,阻止AP由局部向SAP和MODS、PE发展,可试用于AP、PE的实验性治疗。而介导脱髓鞘病变的主要细胞CD+4(Th1)细胞,CsA对辅助性T淋巴细胞的抑制作用,使本实验中的CsA治疗组脱髓鞘改变轻微,而对照组中枢神经系统脱髓鞘改变明显。4csa治疗il-10对大鼠脑胶质瘤组织形态的影响本研究主要