再生障碍性贫血患者h1、h2细胞的功能状态及其与造血衰竭的关系

再生障碍性贫血患者h1、h2细胞的功能状态及其与造血衰竭的关系

根据大量临床和实验研究，t淋巴细胞异常免疫对促进或消除贫困（再障碍）的发生和发展起着重要作用。患者外周血和骨髓T淋巴细胞被异常激活,产生可溶性的细胞因子,如IFN-γ抑制造血。细胞因子调节的中心是CD4+T淋巴细胞,即辅助性T淋巴细胞(Th),为了解Th细胞在再障发生和发展中所起的作用,我们对再障患者的骨髓单个核细胞(BMMNC)及外周血单个核细胞(PBMNC)的Th细胞各亚型的数量、比例、产生细胞因子的功能状态及其与造血衰竭的关系进行了研究。病例和方法1全国再障诊断标准32例再障患者,中位年龄38岁(17～60岁)。其中男18例,女14例,重型再障(SAA)21例,慢性再障(CAA)11例。所有病例均为1999年3月～2001年1月我院收治的初治病例,诊断均符合全国再障诊断标准。病例对照组为26例非再障的血液系统疾病所导致全血细胞减少或贫血和(或)血小板减少患者,男12例,女14例。其中阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者6例、骨髓增生异常综合征(MDS)患者6例,急性白血病(AL)患者5例,BMMNC-Coombs试验阳性的免疫相关性全血细胞减少症(IRP)患者9例。诊断均符合文献标准。11名正常志愿献髓者作为正常骨髓对照,其中男5名,女6名,中位年龄29岁(21～37岁)。17名正常志愿献血者作为正常外周血对照。其中男15名,女12名。中位年龄31岁(19～43岁)。2耐药因子及血清因子细胞培养试剂及细胞体外刺激和抑制剂均购自美国Sigma公司;单克隆抗体鼠抗人CD4-FITC、IFN-γ-PE、IL-4-PE及阴性对照均购自美国BD公司;TRIzol、逆转录酶(M-MLV)购自美国Gibco公司;引物为上海生工生物工程公司合成,其它相关试剂分别购自上海生工生物工程公司。3bmmna的培养和1-tot-trizel-4-pe无菌抽取确诊后治疗前再障患者骨髓7～8ml;外周血10～12ml,非再障患者及健康志愿者骨髓各4～5ml,健康志愿者外周血5～6ml,肝素抗凝,以IMDM培养液适当稀释后,淋巴细胞分离液分离MNC(1800r/min,20min),用IMDM培养液洗3次后计数,分别用于如下试验:①免疫粘附法去除CD4阳性T细胞,采用甲基纤维素半固体培养方法作祖细胞培养,扩增CFU-E、CFU-GM及BFU-E。以IMDM为基本培养基,2×105/mlBMMNC的细胞浓度,接种于24孔板,每孔0.5ml,平行接种3孔,放置于37℃、体积分数为5%的CO2、95%湿度孵箱内培养。分别计数CFU-E、CFU-G(第7天)和BFU-E(第14天)。②收获PBMNC,用IMDM培养液洗2次后,按5×105/ml细胞的浓度培养于以IMDM为基本培养基的混合液中(内含体积分数为10%的FCS、2mol/L谷氨酰胺、50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、10ng/mlPMA+0.4μg/ml依诺霉素+1.7μg/ml莫能霉素),将混合液置于24孔平底板中,同时做平行6孔,在37℃、体积分数为5%的CO2、95%湿度条件下培养和激活5h后,收集细胞1×106/管,共3管,PBS洗2次后,分别加入(Ⅻ)IgG1-FITC;0CD4-FITC;1CD4-FITC,各20μl,置4℃暗室孵育30min,用PBS洗2遍后各加200μl10g/L多聚甲醛,于4℃固定15min,再各自加入(Ⅻ)IgG1-PE;0IFN-γ-PE;1IL-2-PE,各20μl,置4℃暗室孵育45min,用PBS洗2遍后各加500μl10g/L多聚甲醛,用流式细胞仪检测。③用TRIzol试剂提取1×106个BMMNC总RNA,提取的RNA溶于20μlDEPC处理的水中,测吸光度(A)值,A260/A280>1.8,在10g/L琼脂糖凝胶电泳显示证实含18S和28S两条带的标本用于逆转录。cDNA用于进行PCR,IFN-γ引物:5′-AGTTATATCTTGGCTTTTCA,3′-ACCGAATAATTAGTCAGCTT;扩增条件为:94℃45s,50℃1min,72℃1min,循环35次。IL-4引物:5′-TAGCTTCTCCTGATAAACTA,3′-TCCAAGAAGTTTTCCAACGT;扩增条件:94℃45s,56℃1min,72℃90s,循环35次。扩增产物用含0.5μg/mlEB的2g/L琼脂糖凝胶电泳显示,以DNA相对分子质量标志物为标准,电泳完毕后在紫外灯下观察条带并照相。4统计处理均数间比较采用t检验,率的比较采用精确概率法。结果1saa对saa患者骨髓细胞cfu-e产率的影响将去除CD4+细胞前、后SAA患者骨髓造血祖细胞CFU-E数进行配对资料的分析比较,去除CD4+细胞后SAA患者骨髓CFU-E产率较去除CD4+细胞前有显著增加。结果见表1。2saa细胞抗凝细胞受PMA+依诺霉素刺激后活化产生细胞因子,而莫能霉素抑制了细胞因子向细胞外释放,用细胞膜表面抗原及细胞浆抗原检测双标记,CD4+IFN-γ+细胞为Th1,CD4+IL-4+细胞为Th2。SAA患者外周血Th1细胞明显多于正常人,外周血Th1细胞产生的IFN-γ增多;再障患者外周血Th1与Th2细胞明显失衡;再障患者外周血Th2细胞与正常人无明显区别。SAA患者Th1、Th2细胞的变化见表2。3il-4mrna表达再障组共27例,其中SAA患者16例,CAA患者11例。16例SAA患者中13例(81.3%)检测到IFN-γmRNA的表达,仅1例SAA患者(6.3%)检测到IL-4mRNA的表达。11例CAA患者中6例(54.5%)检测到IFN-γmRNA的表达,仅1例CAA患者(9.1%)检测到IL-4mRNA的表达。正常对照11名既未检测到IFN-γmRNA的表达,也未检测到IL-4mRNA的表达。非再障的血液系统疾病所导致的全血细胞减少或贫血患者29例,其中PNH、MDS各6例,既未检测到IFN-γmRNA的表达,也未检测到IL-4mRNA的表达。5例AL患者的BMMNC中未检测到IFN-γmRNA的表达,1例检测到IL-4mRNA的表达,BMMNC-Coombs试验阳性的IRP9例中均未检测到IFN-γmRNA的表达,4例(44.4%)检测到IL-4mRNA的表达。细胞因子发生基因突变临床用免疫抑制治疗能使大部分再障患者得以康复的事实说明免疫机制在再障的发生和发展中起极其重要的作用。再障患者的血清及MNC培养上清中IL-2水平升高,骨髓T淋巴细胞在体外不经预先刺激即可自发产生IFN-γ、IL-2、TNF-α、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α等造血负调控因子。Nistico研究了25例再障患者及39例其它血液系统疾病患者和20名正常对照的骨髓及外周血IFN-γ基因表达的情况,发现18例SAA中有14例骨髓标本中可检测到IFN-γmRNA的表达,无论是健康对照及其它慢性贫血需经常输血者或化疗后全血细胞减少或MDS患者BMMNC无IFN-γmRNA的表达。Nakao等研究发现再障患者不经体外激活的BMMNC的IFN-γ基因表达对预示CsA治疗反应有一定意义。体外实验表明,再障患者T淋巴细胞高分泌TNF-α和IFN-γ等,而TNF-α或IFN-γ可诱导正常人骨髓CD34+细胞Fas的表达增高。再障患者体内高水平的IFN-γ及TNF-α也可诱导其CD34+细胞上Fas抗原的表达增加。这些研究均从不同侧面说明了T淋巴细胞数量及功能的异常及其所造成细胞因子的分泌失调与再障发病密切相关。1990年Romagnami等研究证实人类存在Th1细胞、Th2细胞两种亚型。Th1细胞优势分泌IFN-γ及IL-2,以IFN-γ分泌为主要特征,主要介导细胞免疫,活化细胞毒性T淋巴细胞;Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-10,以IL-4的分泌最具有代表性,主要介导体液免疫,活化B淋巴细胞。Th1和Th2细胞通过分泌细胞因子进行相互调节。近年来,Th1/Th2的失衡与各种免疫相关性疾病的关系成为研究热点。因此,我们开展了对Th细胞在再障发病中作用的研究。我们采用甲基纤维素培养法扩增11例SAA患者BMMNC去除CD4+细胞CFU-E、CFU-GM、BFU-E的数量;发现去除CD4+细胞后SAA患者的骨髓CFU-GM、CFU-E和BFU-E产率都有显著提高。根据Th细胞亚群分泌特征,把SAA患者与正常人PBMNC在体外用刺激剂(PMA+依诺霉素)刺激,并同时加入细胞内蛋白转运抑制剂莫能霉素共同培养后,用直接免疫荧光法对SAA患者与正常人刺激后的PBMNC进行细胞膜CD4及细胞浆IFN-γ、IL-4进行双标记,用流式细胞术检测SAA患者的Th1/Th2亚群状态。结果发现,SAA患者PBMNC中Th1细胞明显高于正常对照组,显示SAA患者体内Th1细胞处于优势。用RT-PCR方法,检测SAA患者及非再障的血液系统疾病所导致的全血细胞减少或贫血和(或)血小板减少患者和正常人的未经刺激的BMMNC中Th1细胞的代表性细胞因子IFN-γ和Th2细胞的代表性因子IL-4的基因表达。发现仅SAA和CAA患者骨髓中优势表达Th1型细胞因子IFN-γ,而非再障的血液系统疾病所致全血细胞减少或贫血和(或)血小板减少患者和正常人的BMMNC中都无IFN-γ的表达。虽然SAA患者因易继发感染和因接受输血,有可能导致IFN-γ的表达,但我们检测的非再障组患者因存在血细胞减少(继发于其它良性及恶性血液病),也常常需要输注异源性的血制品,也容易发生感染,但均无IFN-γ的表达。而且文献报道的IFN-γ的表达与接受异源性的血制品和感染并无相关性。这为骨髓内过多的活化T细胞及其释放局部高浓度的细胞因子作用于造血细胞,进而导致再障患者造血功能抑制,为再障是一种器官特异性的自身免疫性疾病的假设提供了又一依据。而且SAA与CAA比较,骨髓衰竭程度有量的差异,IFN-γ在骨髓T细胞中的表达也是SAA高于CAA,说明T细胞产生IFN-γ与骨髓抑制有量效关系。结合SAA患者的去除BMMNC中的CD4+细胞前、后CFU-GM、CFU-E和BFU-E的产率都有显著提高,表明再障患者骨髓中Th1细胞的量及产生细胞因子IFN-γ的功能异常增高,而且这种增高可能是再障造血功能衰竭的机制,也是再障区别于其它良性及恶性血液病所导致血细胞减少的标志之一。总之,再障的免疫病理