重型再生障碍性贫血发病相关基因表达谱特征及药物治疗的研究

重型再生障碍性贫血发病相关基因表达谱特征及药物治疗的研究

急性再生障碍性贫血（aaa）也称为双旋性介入性贫血i（saa），是一种发病率低、死亡率高的骨髓衰竭性疾病。虽然目前对其发病机制并未完全阐明,但干细胞缺陷、造血微环境紊乱和免疫介导的骨髓干/祖细胞受损等三个方面是目前公认的发病原因。其中免疫毒性作用备受关注,由此而来的免疫抑制治疗,是目前除了骨髓干细胞移植以外治疗急性再障的主要方法。与其他自身免疫性疾病一样,从AA患者体内可以分离出对造血干祖细胞特异性毒性作用的抗原特异性T细胞。尽管如此,目前这一发现并没有对AA的治疗产生影响。包括抗胸腺细胞球蛋白/抗淋巴细胞球蛋白(ATG/ALG)和环孢菌素A在内的细胞免疫抑制剂是治疗SAA的常用免疫抑制剂,这些药物作用的靶细胞是全T细胞,并不具有选择性。在发挥治疗作用的同时,不可避免地对正常T细胞产生毒性作用,其后果就是正常细胞免疫功能受到抑制,继发性肿瘤的发生有时不可避免。而严重的肝肾等重要脏器毒性作用,是非特异性细胞免疫抑制的另一个严重的毒副作用。因此寻找具有高度选择性的,靶向作用于AA发病相关的T细胞克隆的药物是未来AA和SAA治疗的方向。由于AA是一种发病率比较低的疾病,很难开展大样本随机对照临床研究,这是限制其治疗进步的原因之一。生物信息学的发展,有可能在数据库分析的基础上,利用药物基因组学的研究成果,克服临床随机研究不足,预测出具有靶向作用于AA发病相关T细胞的药物,最终达到治疗AA和SAA的目的。本研究试图采用基因组学和药物基因组学方法,筛选出具有治疗SAA的药物。基因表达芯片数据库本研究的所有数据均来源于互联网开放的免费数据库,其中包括:基因表达数据库GeneExpressionOmnibus(GEO)、SAGE、GeneCard、InterPro;基因表达芯片数据库Affymetrix、Clontech;人类基因组数据库(GenBank)。使用的软件平台包括:基因表达聚类分析所使用的软件平台——DAVIDGeneFunctionalClassificationTool;基因表达谱与药物基因组表达谱相似性分析使用的软件平台——ConnectivityMap。saa发病相关基因表达数据库的建立首先以SAA和T淋巴细胞为关键词在基因表达数据库中筛选相关的与SAA发病相关的人类全基因组数据库;在删除无效数据后,计算疾病相关基因,以表达水平变化超过2倍者(>2或<0.5)作为阈值。然后建立SAA发病相关基因表达数据库。以此作为疾病发病相关基因表达数据标签,与临床治疗AA有效的药物雄激素睾丸酮的基因表达谱特征进行相似性分析,以验证所建立的SAA发病相关T淋巴细胞基因表达谱是否与SAA发病的分子病理相符。验证后将此基因表达谱与CAMP软件平台中的3000种药物的基因表达谱进行相似性分析,筛选与SAA发病相关基因表达谱相反的药物,即未来可能治疗SAA有效的药物,分析步骤见图1。结果细胞蛋白表达一共筛选到满足SAA和T淋巴细胞条件的数据库1个,为GEO数据库中的GSE3807。该数据来源于6例SAA患者,外周血或骨髓分离CD3+T淋巴细胞后以HG_U133AGeneChipArrays(affymetrix,santaclara,CA)检测全基因组基因表达结果,其中2例有完整的治疗完全缓解前后的骨髓和外周血基因表达数据。saa完全缓解前后的基因表达考虑到自身发病和完全缓解前后的基因表达变化与SAA发病的相关性更大,因此在包含6例病人共8个基因表达数据库中,仅保留2例SAA完全缓解前后的基因表达数据库进行分析,其余数据均剔除。表达水平变化超过2倍者(>2或<0.5)一共有515个,其中上调者202个(SAA完全缓解以后表达水平超过2倍),下调者313个(SAA完全缓解以后表达水平下降低于2倍)。分别将这些基因进行聚类分析发现,上调者多与核受体、蛋白酶体和泛素等有关,而表达下调的基因多属于生长因子受体类,详见图2和图3。saa发病的分子机理分析目前临床常用的治疗SAA的药物除了ATG/ALG和环孢菌素A以外,在我国最常用的药物为雄激素类药物,其中以睾丸酮应用最广。为此,将筛选出的SAA发病相关的CD3+T细胞转录组与睾丸酮的转录组进行比较,如二者相反,则证实筛选出的转录组与SAA发病的分子机理相符,否则则否。这是确认SAA发病相关CD3+T-细胞基因表达谱的关键。结果发现,本研究筛选出的SAA发病相关基因转录组与睾丸酮的相反,进一步证实了筛选出的基因表达谱可用于进一步的有效治疗SAA药物预测的研究。种药物相关的转录组分析以睾丸酮相关基因转录组初步验证了SAA发病相关T细胞基因表达谱,将后者作为SAA发病的特征性转录组与3000种药物相关的转录组进行相似性分析。结果发现,包括羟喜树碱、维生素B6、维生素K和盐酸二甲双胍等在内的药物与SAA发病的T细胞转录组具有明确的负相关性,即这些药物可能具有潜在的治疗SAA作用。而吗替麦考酚酯、美贝维林、林可霉素、花生四烯酸、山奈酚和石蒜碱等与SAA的发病具有正相关性,即这些药物可能具有潜在的引起SAA的毒性作用(附表)。雷效能抑制剂的筛选SAA虽属罕见,但病死率极高。虽然同胞供者骨髓干细胞移植的效果较好,长期存活率可达75%-90%,但费用很高,且不适宜我国国情;而非血缘供者造血干细胞移植的长期存活率也仅仅为30%左右。因此,寻找安全有效的SAA治疗方法是血液病学领域的当务之急。近年来,分子生物学和生物信息学的迅猛发展,使得利用疾病特异性的转录组与药物基因组学将疾病通过基因与药物联系起来,为寻找有效治疗罕见性、致死性疾病的药物成为可能。Lamb等认为,疾病的发生是由于人类整个基因组的转录组出现了异常的结果,而药物之所以能够治疗疾病也是通过对整个转录组进行干预的结果。通过计算机辅助的统计学方法,将疾病特征性的转录组与药物相关的基因组进行对比分析,可以作为筛选靶向治疗疾病药物的方法。Wei等利用这一方法,成功发现免疫抑制剂雷帕霉素具有逆转成人急性淋巴系白血病耐药的作用,目前已开展的临床研究取得了初步良好的临床疗效。Hassane等利用数据库分析方法也筛选出了清除白血病干细胞的药物。但在我国,目前利用生物信息学方法指导临床研究的报道有限,作者所在课题组在生物信息学指导临床研究方面做了初步的尝试。我们先前利用这一方法,成功发现氨磷汀与重组人红细胞生成素在治疗老年骨髓增生异常综合征方面具有协同作用。对与疾病高度相关性的致病基因,可以利用基因转录组及药物基因组学数据库筛选靶向抑制或上调的药物,为筛选和开发特异性的靶向药物提供指导。本研究初步筛选的结果发现,羟喜树碱、维生素B6、维生素K、盐酸二甲双胍、巯基嘌呤和磺胺吡啶可能具有潜在治疗SAA的作用。其中,羟喜树碱和巯基嘌呤既是免疫抑制剂,也是临床常用的化疗药物,虽然可能具有免疫抑制剂样的作用,从抑制T细胞免疫方面发挥作用,但其对干细胞的杀伤作用使得在治疗AA方面不适用。维生素B6和维生素K都有报道,具有改善骨髓造血作用,作为辅助治疗SAA的药物已在临床应用多年,这再次说明本研究的分析符合临床实际。磺胺吡啶是一种人工合成的抗生素,具有抗菌、消炎和免疫抑制剂作用,可抑制溃疡性结肠炎的发作并延长其缓解期,但长期应用具有药疹,对肝肾功能毒性较大,不适宜长期应用。盐酸二甲双胍是一种用于单纯饮食控制及体育锻炼治疗无效的Ⅱ型糖尿病,特别是肥胖的Ⅱ型糖尿病,其药理学作用为通过促进外周组织利用糖原达到降低血糖的目的,本身比较安全,不会引起低血糖。我国学者Gao等发现,二甲双胍能够选择性抑制大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。而Xu的研究发现,AA患者的骨髓间充质干细胞过度向脂肪细胞分化,即骨髓间充质干细胞过度脂肪化可能是AA发病的原因之一。Nath等的研究还发现,二甲双胍对T细胞的免疫功能具有调节作用,尤其是调节T细胞对自身免疫性疾病系统性硬化病的动物模型具有治疗作用。由此推测,盐酸二甲双胍有可能通过抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,同时对异常的T细胞功能进行调节,抑