生药的有效性评价

生药的有效性评价生药的有效性评价

(Efficacyevaluation)

生物检定法（Bioassay）

与疗效相关联的化学成分分析法(Analysisofbioactivecomponents)生药的生物效应评价法

定义：…它以药物的药理作用为基础、生物统计为工具，运用特定的实验设计，在严格控制的试验条件下，通过比较标准品和供试品对生物体或离体器官与组织的特定生物效应，计算供试品的效价（Potency）或者毒性（Toxicity）

，从而控制和评价供试品质量或活性。。生药的有效性评价方法之一：对一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物。如胰岛素、肝素、缩宫素及各种抗生素等。微量生理活性物质。如Ach、5-HT某些有害杂质的限度检查如农药残留量、内毒素等致热物质、抗生素及生化制剂中降压物质的限度检查等。应用范围：中药及复方:中药成分复杂，大部分中药的有效成分尚未搞清，难以用理化方法加以控制，但可用一些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其质量。应用范围：Example1

洋地黄生物检定法比较洋地黄标准品(S)与供试品(T)对鸽的最小公斤致死量，从而测定供试品的效价。死亡前有强烈颤抖、恶心呕吐、排便等反应。最后至瞳孔放大、呼吸停止为注射终点。抗凝血酶活性测定法：水蛭提取物牛纤维蛋白原+凝血酶(滴定)至有凝固物出现Example2水蛭抗凝血酶活性测定淀粉酶活力测定法：麦芽提取物淀粉+反应，反应终止麦芽糖Example3麦芽中淀粉酶活力测定a,b淀粉酶（底物）3，5-二硝基水杨酸棕红色（540nm）生药化学成分分析法生药的有效性评价方法之二：

定义：应用范围：两种评价方法的比较生物检定法理化分析法测定结果能直接反映药物的效价；是理化分析法的有力补充测定结果误差较大，重现性较差；加上测定费时，计算繁琐；难以构建合适的药理模型以反映中药整体作用的特点测定结果重现性好，易于控制与推广测定结果与活性之间的相关性差MethodsAdvantagesDisadvantages一、紫外-可见分光光度法

(Ultraviolet-visiblespectrometry)朗伯-比尔定律:A=ECL

1、原理：单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度成正比。双光束扫描扫描范围：190nm~800nm常量池（3ml）和微量池（50～120ul）配置UVProbo软件操作系统在操作系统控制下，可完成紫外可见光谱扫描、动力学测定、单波长和多波长的定量分析、数据图形处理以及规范化报告生成。

岛津2450型紫外可见分光光度计2、仪器3、紫外-可见分光光度法定量方法对照品比较法吸收系数法标准曲线法适用对象:

生药中大类成分的含量测定，如总黄酮、总蒽醌、总生物碱等。4、应用槐花（米）中总黄酮的比色法测定：药材提取物＋亚硝酸钠＋硝酸铝＋氢氧化钠500nm处测定平贝母中总生物碱的含量测定—酸性染料比色法药材总生物碱pH5溴百里香酚蓝

比色法测定412nm二、色谱法

(Chromatography)

薄层色谱法

(thinlayerchromatography,TLC)

气相色谱法

(gaschromatography,GC)高效液相色谱法

（highperformanceliquidchromatography,HPLC）（一）薄层色谱法

(thinlayerchromatography,TLC)

薄层板(plate)点样(loading)展开(developing)显色与检视(visualization&detection)记录(recording)1、TLC一般操作程序在计算机控制下，可自动完成点样－展开－显色－扫描－照像－彩色图片输出等一整套工作程序。瑞士CAMAG薄层色谱扫描仪2、TLC仪器《中国药典》(2010年版)一部薄层色谱法用于定性鉴别的达2000多项。多用于鉴别、限量检查:3、TLC的应用斑点颜色、Rf值

依据简便、快速、适应性广、可操作性强

优势薄层扫描法定量（TLCS）3、TLC的应用（定量分析）酸枣仁中酸枣仁皂苷A、B的TLCS法测定3、TLC的应用（定量分析）薄层色谱－紫外可见分光光度法定量（TLC-UV）点样展开定位刮板洗脱UV测定（二）高效液相色谱法

（highperformanceliquidchromatography,HPLC）1、HPLC仪Agilent1100SeriesHPLCSystems

硅胶---正相色谱化学键合硅胶---反相色谱离子交换填充剂---离子交换色谱凝胶---分子排阻色谱手性键合填充剂---对映异构体拆分色谱柱2、HPLC仪组成

紫外检测器(ultravioletdetector,UVD)

二极管阵列检测器(diodearraydetector,DAD)

荧光检测器(fluorescencedetector,FLD)

电化学检测器(electrochemicaldetector,ECD)选择性检测器检测器－2、HPLC仪组成示差折光检测器(refractiveindexdetector,RID)蒸发光散射检测器(evaporativelight-scatteringdetector,ELSD)质谱检测器(massspectrometricaldetector,MSD)

通用型检测器

检测器－2、HPLC仪组成Alltech2000蒸发光散射检测器Agilent液质联用仪3、HPLC定性方法min01020304050mAU010203040506070三个定性参数:tR值、UV、MSnm200225250275300325350375mAU0255075100125150UVm/z100200300400020406080100211.1189.1399.2227.1[M+Na]+[M+K]+[2M+Na]+[M+H]+MS内标校正因子法：外标法：面积归一化法：纯度检测《中国药典》(2010年版）一部应用HPLC法测定含量的中药品种达1700余项。

HPLC优势：4、HPLC定量方法5、HPLC的应用7-epi-loganin(1)sweroside(2)loganin(3)7-epi-vogeloside(4)secoxyloganin(5)1.金丝桃苷；2.异槲皮苷1.金丝桃苷；2.异槲皮苷1.金丝桃苷；2.异槲皮苷UPLC的原理：vanDeemter方程UPLC1.7umParticle2004’sUPLC的优势高分离度高速度高灵敏度AgilentRRLCShimadzuUFLCAgilent6890N型气相色谱仪（三）气相色谱法

（Gaschromatography,GC）1、GC仪载气：H2、N2、He进样系统：溶液直接进样或顶空进样色谱柱：弹性石英毛细管柱柱温箱：恒温和程序升温检测器：2、GC仪组成弹性石英毛细管柱不锈钢填充柱涂壁毛细管柱载体涂层毛细管柱2、GC仪组成色谱柱检测器火焰离子化检测器(flameionizationdetector,FID)热导检测器(thermalconductivitydetector,TCD)氮磷检测器(nitrogen-phosphorusdetector,NPD)火焰光度检测器(flamephotometricdetector,FPD)电子捕获检测器(electroncapturedetector,ECD)质谱检测器(massspectrometricdetector,MSD)2、GC仪组成3、GC定性方法两个定性参数:tR值、MS4、GC定量方法内标校正因子法外标法面积归一化法标准溶液加入法《中国药典》(2010年版)气相色谱法用于中药分析的品种有50余种。5、GC法的应用Pogostemoncablin中patchoulialcohol、pogostone的测定高效毛细管电泳

(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)毛细管电色谱

(capillaryelectrochromatography，CEC）液相色谱与核磁共振联用(LC-NMR)LC/NMR/MS（四）其他色谱法

（Miscellaneouschromatography）HPCEHPLC-MS三、定量分析方法的方法学验证

(Validationoftheanalyticalmethod)目的：证明采用的分析方法适合于相应检测要求。方法验证用于：

建立新的分析方法时原分析方法进行修订时(一)验证内容线性及范围（linearityandrange）准确度(accuracy)专属性（specificity）精密度（precision）重复性（repeatability）重现性（reproducibility）检测限及定量限（limitofdetectionandquantification）耐用性(robustness)1、线性（linearity）和范围（range）线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度。范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。(二)实验设计线性（linearity）和范围（range）AnalytestRCalibrationcurver2

testrange

mg/ml线性（linearity）和范围（range）2、准确度(accuracy)准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示；回收率%=（实测值-供试品所含被测成分量）/加入对照品量对照品药材量（g）药材中对照品含量(mg)加入量(mg)测得总量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)

贝母素乙

1.00550.67870.66401.325397.4100.42.941.00040.67530.66401.34391.00020.67510.66401.35741.00050.67530.66401.33891.00060.67540.66401.320497.11.00020.67510.66401.3698104.6准确度(accuracy)--加样回收率100.7102.899.9对照品药材量（g）药材中对照品含量(mg)加入量(mg)测得总量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)

丹酚酸B0.15018.72高9.9718.88101.9100.9±2.62.60.15008.7210.0118.98102.50.15028.7310.0518.92101.40.14998.71中17.53101.80.15018.7217.60102.60.15038.7417.63100.00.14988.71低6.9715.98104.30.15018.726.5615.1497.80.14998.716.6715.1095.7准确度(accuracy)--加样回收率8.668.658.893、专属性（specificity）专属性系指在其他成分可能存在时，采用的方法能正确测定出被测物的特性。专属性常用的试验方法:

空白阴性对照试验比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱色谱-质谱联用验证待测成分忍冬苷

木犀草苷

芦丁金丝桃苷木犀草苷忍冬苷金丝桃苷芦丁2005年版中国药典分离条件下木犀草苷与忍冬苷共流出对照品对照品金银花中忍冬苷（MW594)和木犀草苷(MW448)提取离子流图忍冬苷木犀草苷MW594MW448新方法(2010年版中国药典)对照品的分离图芦丁金丝桃苷绿原酸忍冬苷木犀草苷对照品样品UVMSUVMS采用HPLC-DAD-MS联用技术，测定待测色谱峰的紫外吸收光谱及质谱来判断色谱峰的纯度，确保分析方法的专属性。4、精密度（precision）精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。精密度通常包括以下三个方面的含义：重复性(repeatability):批内精密度（intra-assayprecision）中间精密度(intermediateprecision)

重现性(reproducibility)中间精密度表示方法

日内精密度(intra-dayvariability)日间精密度(inter-dayvariability)浓度日内精密度（n=6)日间精密度（n=3)峰面积（X）X±SDRSD(%)峰面积（X）X±SDRSD(%)137mg/mL6265.06373.3±751.26351.86351.3±681.16299.76385.36282.46400.96431.36419.76457.627.4mg/mL1315.81302.3±131.01294.81322.6±312.41317.21284.01316.51291.41299.41356.61305.813.7mg/mL489.3493.5±3.80.76490.0498.6±142.9490.5493.3490.6497.4498.7515.2492.0重复性（repeatability）重复性是指在同一条件下对同一批样品，从样品供试品制备开始，制备至少六份以上供试品溶液(即n>6)，或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试溶液，进行测定，计算其含量的平均值和相对标准偏差(RSD)。样品质量(g)丹酚酸B（％）丹参酮ⅡA（％）高0.50055.7485±0.03250.4540±0.00230.50045.6514±0.06430.4594±0.00210.49995.7763±0.00820.4529±0.0007中0.30035.8647±0.01350.4575±0.00110.30035.7112±0.03530.4539±0.00290.30065.6947±0.02320.4430±0.0021低0.19995.8618±0.07040.4751±0.00230.20056.0239±0.01170.4489±0.00290.20015.9838±0.05090.4502±0.0096平均值±SD(%)5.8129±0.12980.4550±0.0090RSD(%)2.2