实验六细胞周期检测

实验六：细胞周期检测细胞周期(cell

cycle)指细胞第一次分裂结束到第二次分裂结束所经历的全过程，分为 间期与分裂期两个阶段。间期分为三期：DNA合成前期（G1期）DNA合成期（S期）DNA合成后期（G2期）细胞分裂期（M期）前期，中期，后期，末期。G0期：暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功 能的细胞所处的时期。体内细胞分类在体内根据细胞的分裂能力可把它们分为三类： 周期性细胞，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环； 终端分化细胞，如成熟的红细胞、神经细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end

cell）； 暂不增殖细胞群（G0期细胞），如肝细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。碧云天的细胞周期检测试剂盒一种采用经典的碘化丙啶染色(Propidiumstaining，即PIstaining)方法进行细胞周期分析的检测试剂盒。碘化丙啶(Propidium，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的

G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-

2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA

fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。流式细胞术血清饥饿法饥饿72h之后细胞同步化后流式细胞仪分析；结果显示，与对照组相比，mortalin表达量上调的细胞快速从G1

期过渡到G2/M期实验步骤1.细胞样品的准备：对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶 消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入 前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细 胞。再次收集到离心管内。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细 胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离 心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的

PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避 免细胞成团。细胞固定：加入1毫升冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或 更长时间。固定12-24小时可能效果更佳。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇，以避免吸走 细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的

PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避 免细胞成团。3.

碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配 制适量的碘化丙啶染色液：注：配制好的碘化丙啶染色液短时间内可以4℃保存，宜当日使 用。4.

染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并 充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴 避光存放。染色完成后宜在24小时内完成流式检测，最好能在当 日