线粒体功能专业知识讲座

线粒体功能及其检测

第1页线粒体结构第2页线粒体是真核细胞一种细胞器，包括四个功能区隔:外膜、内膜、膜间隙和基质。主要化学成份是蛋白质和脂类，其中蛋白质占65-70%，脂类占25-30%。

第3页外膜(outmembrane)膜孔蛋白（porin）、离子通道蛋白以及Bcl-2家族蛋白。由膜孔蛋白组成亲水通道，允许分子量为5KD下列分子通过，1KD下列分子可自由通过。第4页内膜（innermembrane）电子传递链(呼吸链)复合物I~IV和复合物V(ATP合成酶)。通透性很低，仅允许不带电荷小分子物质通过，大分子和离子通过内膜时需要特殊转运系统。第5页膜间隙(intermembranespace)

细胞色素C电压依赖性阴离子通道(VDAC)、ADP/ATP转换蛋白。线粒体膜转运孔道(mitochondrialpermeabletransitionpore，MPTP)存在于内外膜接触点。凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor，AIF)和Procaspase2、3、9及其他酶蛋白。第6页基质（matrix）三羧酸循环：除糖酵解在细胞质中进行外，其他生物氧化过程都在线粒体中进行。催化三羧酸循环，脂肪酸和丙酮酸氧化酶类均位于基质中。线粒体基因组：基质具有一套完整转录和翻译体系。包括线粒体DNA（mtDNA），70S型核糖体，tRNAs、rRNA、DNA聚合酶等。存放钙离子致密颗粒。第7页线粒体DNA第8页线粒体基因组哺乳动物线粒体基因DNA没有内含子，几乎每一对核苷酸都参与一种基因组成。线粒体基因组能够单独进行复制、转录及合成蛋白质。仅有少数线粒体蛋白质是由mtDNA编码，大多数线粒体蛋白质（90%）还是由核DNA编码。第9页mtDNA环状，编码2种rRNA、22种tRNA和13种参与呼吸链形成多肽。一般裸露且不含内含子，既缺乏组蛋白保护和完善自我修复系统，又接近内膜呼吸链，极易受环境影响，突变频率比nDNA高10~20倍。假如线粒体DNA发生突变，不能产生足够ATP而造成细胞功能减退甚至死亡，临床上体现复杂多样，即线粒体病。母系遗传。第10页线粒体功能第11页能量供应氧化应激凋亡钙储池细胞周期、信号转导肿瘤发育等第12页线粒体与能量供应第13页细胞有氧呼吸和供能场所，供应细胞生命活动95%能量。线粒体主要功能是把氧化多种底物产生自由能转化为可被细胞直接利用形式－ATP。线粒体具有能量代谢与自由基代谢两条途径。第14页①燃料分解（胞质中）②乙酰CoA生成③三羧酸循环(线粒体基质)④电子传递和氧化磷酸化(内膜上)生成ATP葡萄糖脂肪酸氨基酸第15页线粒体与氧化应激第16页线粒体是细胞中产生活性氧一种主要部位，消耗氧用于合成ATP同步不可避免地产生活性氧。氧化应激作用下，膜转运孔道开放造成线粒体基质内高渗入压，使线粒体内外H+梯度消失，呼吸链脱偶联，能量产生中断。还会由于水和溶质进入使基质肿胀并造成外膜破裂，通透性增高，释放出包括细胞色素C在内多种活性蛋白。第17页过多自由基产生可造成mtDNA损伤，氧化损伤是mtDNA突变主要原因。线粒体本身也极易受氧化应激袭击。第18页活性氧在启动和调整细胞凋亡过程中扮演着主要角色。活性氧积累能够造成：线粒体膨大，线粒体内膜非特异性孔道产生；细胞色素C从内膜脱落并进入到胞质中；BAX体现，caspase活化等。这些都是启动细胞凋亡原因。第19页线粒体与凋亡第20页从线粒体释放细胞色素C与凋亡诱导因子、Procaspase9结合在一起形成“凋亡体”（Apoptosome），造成Caspase9和Caspase3激活。内膜Bcl-2家族蛋白调控紊乱。Caspases激活、胞浆Ca++水平升高、产生神经酰胺，直接或间接地引发膜转运孔道连续开放。ROS－膜转运孔道连续开放－凋亡第21页钙储池第22页线粒体感受到钙微区，通过膜上协同转运体将钙摄入基质，然后以磷酸钙形式储存在某些较大致密颗粒中。积累Ca2+又能够通过钠－钙交换系统和膜转运孔道再次释放到胞质，从而调整胞浆中钙离子动态平衡，影响细胞内许多有关生理活动，如信号传导、能量代谢和细胞凋亡。Ca2+能结合线粒体膜转运孔道上金属结合位点，开放膜转运孔道，从而诱导渗入压变化、ATP耗竭和线粒体皱缩，细胞色素C释放，活化Caspase9和Caspase3，诱发细胞凋亡。第23页线粒体功能紊乱第24页线粒体病（primarygeneticdefects）线粒体病理性损伤第25页线粒体病第26页mtDNA突变(点突变、缺失、插入）造成线粒体功能缺陷。如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病、老年性痴呆、帕金森病、糖尿病等。mtDNA突变伴随年纪累积。第27页mtDNA突变呼吸链复合体I～IV活性下降ATP合成减少氧自由基产生增多钙稳态失衡脂质氧化增强线粒体功能变化第28页线粒体病理性损伤第29页II型糖尿病胰岛β细胞线粒体参与胰岛素分泌、胰岛素抵抗形成。线粒体是高血糖时细胞ROS主要起源。线粒体氧自由基增多与糖尿病微血管并发症发病机制有关。线粒体本身受氧化应激袭击，造成mtDNA合成减少、发生突变。第30页glucose-inducedROSinitiatesmesangialcellsapoptosisglucose-inducedROSinitiatespodocyteapoptosisanddepletionglucose-inducedROSinitiatesendothelialcellapoptosisglucose-inducedROSinitiatestubularcellsapoptosis糖尿病肾病Highglucose－mitochondrialROS－kidneycellsapoptosis第31页Nitrotyrosinelevel(硝基酪氨酸,markerofoxidativestress)complexIandcomplexVATP/ADPratioUncouplingprotein-2(UCP-2)expressionmembranepotentialM.Anelloetal.Functionalandmorphologicalalterationsofmitochondriainpancreaticbetacellsfromtype2diabeticpatients.Diabetologia,(2023)48:282–2897cases,clinicaldiabeteswas5.6±0.6years胰岛组织:第32页8-羟基脱氧鸟嘌呤

(8-OHdG，kidneyandurine)MitochondrialDNADeletionCOXI/COXIV(mtDNA/nDNA)MaikoKakimoto,ToyoshiInoguchi,ToshiyoSonta.Accumulationof8-Hydroxy-2’-DeoxyguanosineandMitochondrialDNADeletioninKidneyofDiabeticRats.Diabetes51:1588–1595,2023STZrats,观测时间：4，8周肾组织:第33页NADHdehydrogenase(complexI)cytochrome-coxidase(complexIV)COXImtDNAlevelsmtDNAdeletionDirkLebrecht1,BernhardSetzer1,RolfRohrbach,etal.MitochondrialDNAanditsrespiratorychainproductsaredefectiveindoxorubicinnephrosis.NephrolDialTransplant,2023,19:329–336doxorubicinnephrosisrats肾组织：第34页ATP膜转运通道开放程度cytochromeccaspase3Ca++PerazaMA,etal.Morphologicalandfunctionalalterationsinhumanproximaltubularcelllineinducedbylowlevelinorganicarsenic:evidencefortargetingofmitochondriaandinitiatedapoptosis.JApplToxicol.2023,26(4):356-67体外培养肾小管上皮细胞第35页线粒体功能检测第36页enzymeactivityassays(分光光度法)

NADH(complexI),succinatedehydrogenase(complexII)细胞色素c还原酶(complexIII)

COX(complexIV)ATP（luciferin/luciferase发光法，核磁共振法）呼吸控制率(ATP合成功能，氧电极法)能量供应第37页氧化应激8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG，ELISA法)ROS(分光光度法)glutathioneandcoenzymeQ(分光光度法,HPLC)第38页细胞色素C含量（westernblot)caspase