通心络对脑缺血大鼠脑组织微血管新生及血流灌注状态的影响

通心络对脑缺血大鼠脑组织微血管新生及血流灌注状态的影响

缺血性脑梗死是脑瘫疾病的一种常见类型。由于出血和脑损伤，脑组织会出现缺氧、缺氧和坏死状态。及时恢复血流灌注成为挽救部分可逆性损伤神经元,减小脑梗死面积,促进神经功能恢复最有效的方法。治疗性血管新生可以改善缺血区周围的组织灌注,增加脑血流量,从而增加受损脑组织的氧供,代偿这种破坏性影响,从而促进神经系统的恢复。材料和方法1动物2药品、试剂与仪器通心络超微粉(由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成,1.47g生药/g,石家庄以岭药业股份有限公司提供,批号20090430)用0.9%生理盐水配制,4℃保存;尼莫地平10mg/片,拜耳医药保健公司提供,批号H20003010。3试剂:水合氯醛、多聚甲醛、dna-2000电子天平vt0103CD31羊抗鼠多克隆抗体(美国SantaCruz公司,批号sc-1506);FITC-右旋糖酐(美国Sigma公司,50mg/mL,分子量2×106);水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂,批号20090228);多聚甲醛(天津市永大化学试剂开发中心,批号20090513);SANYO超低温冰箱(日本三洋);DT-2000电子天平[美国双杰兄弟(集团)有限公司];VT1000s型振动切片机(德国Leica公司);LSM-510META型激光扫描共聚焦显微镜(德国ZEISS公司);RM2125切片机(中国上海LEICA公司)。4方法4.1皮肤需要剪开哌肌参照文献,10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5mL/kg)后,侧卧位,于左侧眼眶后至耳的中点纵形切开皮肤,沿颞骨缘剪开颞肌筋膜,直至完全暴露颞骨的颞鳞和蝶骨大翼,在颧弓上方颞鳞与蝶骨大翼交界处进行钻孔,以尖头手术刀切开硬膜,可见横过嗅束向上行走的大脑中动脉,用11/0号手术线结扎大脑中动脉中段。假手术组大鼠只挑开脑膜,不结扎血管,于手术创面撒少许青霉素药粉,随后分层缝合肌肉和皮肤,单笼饲养。4.2大鼠的一般情况参照BedersonJB等方法稍加改进,对大鼠神经功能障碍程度评分:0分,无任何神经功能丧失;1分,右前肢不能充分伸展;2分,提尾时向右环形或旋转运动;3分,向右转圈,成追尾状或向右倾倒;4分,不能自然行走或无自发活动意识障碍者。神经功能障碍评分1~3分的大鼠随机分为假手术组、模型组、通心络大、中、小剂量组和尼莫地平组。其中假手术组和模型组以等体积的生理盐水灌胃,通心络大、中、小剂量组参照文献分别以每天1.6、0.8、0.4g/kg灌胃,相当于临床用量的16、8、4倍,即每天2.4、1.2、0.6g生药/kg灌胃,尼莫地平组每天以10mg/kg,1次/d灌胃。各组分别于给药后14天处死8只动物进行检测。4.3观察项目4.3.1干预皮质微血管密度cd314.3.2x-y平面扫描结果10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5mL/kg),股静脉注射0.1mLFITC-右旋糖酐,1min后断头,取出脑组织置于4%多聚甲醛中,4℃避光保存固定48h,取视交叉部位用振动切片机行冠状切片,片厚150μm。用激光扫描共聚焦显微镜观察,激发波长488nm,20×镜下,x-y平面采用512×512像素,2×面平均,2×线平均,z轴方向每0.5μm扫一层,共扫100个层面,获得图像体积为750μm×750μm×50μm,将所获得的图像进行三维重建,用绿色荧光所占的体积表示血浆容量,通过图像叠加和像素计算的方式测定绿色荧光所占的体积,即扫描组织的血浆容量,血流灌注量的值以扫描区血浆容量与扫描区总容量的百分比表示。用40×镜下获得的图像分析血管直径<8μm的血管,观察血管形态。4.4数据统计分析采用SPSS17.0统计软件分析,所有数据用表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两间比较采用LSD法检验,P<0.05为差异有统计学意义。各组大鼠脑出血微血管走形和规则比较免疫组化结果显示,正常脑组织阳性染色细胞少数散在分布,模型组阳性染色细胞增多,通心络大、中剂量组,尼莫地平组阳性染色细胞分布密集且着色显著,均强于模型组(P<0.05),其中以通心络大剂量组增多明显(P<0.01)。与假手术组比较,模型组大脑皮层微血管走形紊乱、不规则;与模型组比较,通心络大剂量组血管明显呈迂曲、不规则,微血管分支数目增多,血管之间靠拢形成连接。与模型组比较,通心络大、中剂量组,尼莫地平组脑缺血皮层区微血管的血流灌注量增加(P<0.01,P<0.05),尤其通心络大剂量组能够显著促进脑缺血皮层区微血管的血流灌注量(P<0.01)。通心络促进脑缺血后微血管新生的机制目前在血管新生的研究中,微血管密度(MVD)是普遍采用较直观和有效反映新生血管数目和侧支循环建立情况的指标,CD31主要由内皮细胞和淋巴结中分化期的单核细胞分泌,存在于血管内皮和血小板中的一种糖蛋白,也是内皮细胞的一种特异性标记物。因此,将CD31作为特异性标记物,来反映组织中微血管密度的方法已经被广泛采用。KrupinskiJ对10名存活5~92天的脑梗死患者脑组织梗死区和梗死周围区的研究发现,梗死周围区中微血管密度明显高于正常脑组织,而且微血管密度增高的程度与患者生存时间长短相关。脑梗死半球血管密度随时间的延长有不同程度的增加。脑梗死5天后,患者梗死侧脑血管密度较对侧增加18.3%~32.9%,梗死92天后血管密度增加68.6%,血管数量的增多使缺血周围组织血供得以改善,神经功能恢复。本实验结果显示通心络能够显著促进脑缺血后CD31的蛋白表达,另有研究表明通心络能够增加血清NO、VEGF以及缺血脑组织中血管新生相关因子的基因和蛋白表达,可能是通心络促进脑微血管新生的机制之一。激光扫描共聚焦显微镜是近年发展起来的医学图像分析仪器,它可以用于观察脑血流灌注、脑血管直径,其三维重建技术能更好地显示血管形态的变化。本研究结果显示通心络大剂量组缺血侧皮层区的血流灌注量明显高于模型组(P<0.01),LinTN等研究发现,缺血侧脑血流量从第1~14天明显增高,这表明通心络能显著改善缺血大脑皮层的血流灌注,增加神经元血循环。通心络能够增加缺血区微血管密度,微血管分支数目明显增多,提示通心络能够促进缺血区微血管新生,血流灌注量的增加很可能为这些新生血管所致,这表明新生的微血管可以增加缺血脑组织的血流灌注量,发挥一定的代偿作用。研究表明,神经功能的恢复与缺血后大脑皮层血管生成和血流量有很强的相关性。新生的血管可以启发轴突和树突的发芽以及神经再生。因此通心络促进脑缺血后微血管新生,增加缺血脑组织的血流灌注量,发挥一定的代偿作用,可能是脑缺血后神经功能恢复的机制之一,但是对于通心络促进脑微血管新生的分子学证据还需进一步研究。心脏灌注固定后立即取脑,4%多聚甲醛固定48h后,石蜡包埋,于视交叉前缘开始作8μm厚冠状切片,Sp法CD31免疫组化试剂盒进行染色标记,DAB显色10min,苏木素复染,二甲苯透明、中性树胶封片。细胞呈现黄色或棕黄色染色者为阳性细胞,每组选取3张切片,随机选取各切片的缺血周边区相应区域内5个高倍视野记数阳性细胞,用计算机图像分析系统计数免疫反应阳性细胞。健康SPF级雄性SD大鼠48只,约5周龄,体质量110~140g,由北京