肝在实验性内毒素血症中的免疫调节作用

肝在实验性内毒素血症中的免疫调节作用

肿瘤坏死因子（tnf）是一个重要的因素。在动物体内，单个细胞主要受致病性微生物、寄生虫和毒素的刺激。它具有广泛多样的生物活性，不仅是免疫效应的材料，也是免疫调节的分子。一方面它可以直接杀伤肿瘤细胞,诱导某些病毒感染细胞的凋亡,另一方面可广泛激活机体免疫系统,诱导血管内皮细胞表达细胞间粘附分子-1(ICAM-1),增强组织MHC-Ⅰ类分子的表达,诱导肝脏急性期反应蛋白的合成。近年的研究表明,内毒素血症在肝硬化、急性肝衰竭等疾病的发生发展中发挥重要作用,其中由激活的枯否细胞分泌的TNF-α是一种重要的介质。为了探讨在内毒素血症,特别是肠源性内毒素血症中肝脏TNF-α的分泌特点,本研究在山羊采用慢性多血管插管的方法,经不同途径灌注细菌脂多糖,观测了TNF-α水平的动态变化。材料和方法1实验动物17只当地雄性去势山羊,购自江苏省溧水县农户,体重(16.75±1.79)kg,年龄1-2岁,自由饮水,饲以刈割的青干草。2术后全麻处理所有的动物自购入后经1周以上的正常饲养。术前动物禁食24-36h,右侧腹壁剪毛消毒,肌注氯胺酮(1mg/kg)诱导麻醉,10min后再肌注速眠新(解放军军需大学生产)0.5mL进行全麻。左侧卧固定,首先装置颈静脉插管。右侧软腹壁采用普鲁卡因局部麻醉,手术开腹,顺序装置肝静脉和门静脉插管。各插管内充满1∶400的肝素钠灭菌生理盐水溶液。缝合创口。术后每日肌注青霉素160万单位,链霉素200mg,并更换管内液体1次,连续4d。术后第5d进行脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)灌注实验。3织物灌注前血样采集LPS购自美国Sigma公司,提取自O55:B5型大肠杆菌。用前以灭菌生理盐水配制成两种浓度:①2×104内毒素单位(EU)/L;②3mg/L,相当于1.5×106EU/L。本试验分3组进行:组①经门静脉灌注低剂量LPS(20EU/kg体重),共5例;组②经颈静脉灌注低剂量LPS(20EU/kg体重),共5例;组③经颈静脉灌注高剂量LPS(1500EU/kg体重),共7例。受试动物于灌注LPS前分别采集颈静脉、门静脉及肝静脉血,作为灌注前血样,LPS溶液预热到接近体温时进行灌注,保持缓慢而均匀的灌速,于15min内灌完。灌注后1、2、3、5、8h通过各血管插管采集颈静脉、门静脉和肝静脉血样,肝素抗凝,1500r/min离心15min分离血浆,-20℃保存待测。采样的同时还用直肠体温计测定了直肠温度,插入深度约8cm。4中心操作要点中心TNF-α水平的测定采用放射免疫分析法,试剂盒购自解放军总医院科技开发中心,批内误差为5%,批间变异系数为8%,操作严格按说明书进行。采用BasicStatistics5.0软件进行统计运算,统计数据以平均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,差异显著性检验采用t-检验法。结果1灌注lps前后大鼠的服刑状况在组①及组②,灌注LPS后动物的精神状态未见明显改变;但直肠温度有不同程度的变化;在组①,1h时直肠温度出现上升趋势,变化幅度为0.61℃;在组②,1h时直肠温度显著升高(P<0.05),升高的幅度为1.02℃。在组③,灌注LPS后动物的精神状态有明显改变,表现为精神沉郁,食欲、饮欲消失,腹胀,4h时精神状态恢复;直肠温度较灌注前有极显著的升高(P<0.01),上升幅度为1.36℃。2血浆tnf-i水平动态变化2.1变化过程中的变化图1显示组①颈静脉、门静脉及肝静脉血TNF-α水平的变化过程。结果表明,与灌注前相比,颈静脉、门静脉及肝静脉血TNF-α水平未出现显著变化(P>0.05),仅肝静脉和门静脉血TNF-α水平在3-5h出现上升趋势。2.2lps后zs-bs的变化图2显示组②TNF-α水平的变化过程。灌注LPS后各静脉血出现不同程度的波动性变化(P>0.05),其中颈静脉血在1h出现上升趋势,门静脉血在0-8h出现缓慢上升趋势。2.3灌注前后肝静脉血tnf-的变化图3显示组③颈静脉、肝静脉和门静脉血TNF-α水平的变化过程。LPS灌注后1h颈静脉、肝静脉及门静脉TNF-α水平均有迅速升高,并达到峰值,其值分别是(0.760±0.052)μg·L-1、(0.820±0.050)μg·L-1和(0.711±0.071)μg·L-1,较灌注前分别上升了0.311μg·L-1、0.353μg·L-1和0.260μg·L-1,以肝静脉血TNF-α上升幅度最高;1h之后,各静脉血浆TNF-α水平迅速降低,至4h降到接近灌注前的水平,4-8h期间颈静脉及门静脉血中TNF-α的浓度继续下降而肝静脉血的则稍有升高。与灌注前比较,灌注后1-2h颈静脉、肝静脉及门静脉均出现显著差异(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)(图3)。在8h时,肝静脉TNF-α水平仍然显著高于同时间点颈静脉和门静脉(P<0.05)。低剂量lps时肝脏tnf-变化的变化TNF-α的动态变化是LPS刺激后极为重要的观察指标。小鼠的在体研究表明,肝脏Kupffer细胞是LPS诱导下TNF-α产生的重要来源,用Kupffer细胞特异性阻断剂可使LPS诱导的TNF-α产生下降90%左右,表明了肝脏的重要免疫调节机能。大量在体研究表明,机体在LPS静脉灌注或腹腔注射后,TNF-α在60-90min呈现迅速而暂时的分泌高峰。但这一结论多数来自颈静脉和尾静脉的灌注和采样。在慢性实验条件下,采用多血管插管以不同途径、不同剂量尤其是低剂量灌注LPS对TNF-α影响的报道尚未见到。本结果表明,不同剂量、不同途径给予LPS后,肝静脉血中TNF-α呈现出不同的动态变化。在TNF-α的反应时程上可见,经门静脉灌注低剂量LPS后,肝静脉血和门静脉血中TNF-α在5h出现上升趋势,而不是在1h,此种滞后现象的本质尚不清楚。由于从门静脉注入的LPS首先进入肝脏,而肝脏又是体内LPS灭活的主要器官,进入肝脏的小剂量LPS将大部分通过吞噬或吞饮被肝内组织特别是枯否细胞清除,推测仅有极少量的LPS跨越肝脏经肝静脉进入体循环静脉,而经颈静脉进入的LPS则可首先作用于血液内游离的单核细胞,引起TNF-α的分泌,因此灌注LPS的途径不同,将引起不同的TNF-α分泌动态。其次,LPS作用于肝脏的时间也是要考虑的问题。正常情况下血液中存在着能与LPS结合的物质,如脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein,LBP)、游离CD14、高密度脂蛋白等,这些物质有的能促进单核巨噬细胞分泌细胞因子,有的能促进LPS的清除。经门静脉灌注与经颈静脉灌注时,推测LPS在与肝脏细胞作用前与血液中上述物质结合的时间不同,结合率及结合物种类亦有差异,导致TNF-α释放动态的不同。第三,考虑到组①中肝静脉及门静脉血中TNF-α的滞后性升高,我们推测小剂量LPS作用于肝脏时,肝脏释放了某种未知因子,抑制了肝脏及门静脉汇流区(肠道和脾)TNF-α的释放。其中一个可能的因素是IL-6。IL-6有显著的抑制TNF-α释放的作用。刘为民等在山羊观测到从颈静脉灌注大剂量LPS时,肝静脉血、门静脉血和颈静脉血中TNF-α和IL-6的反向变化趋势。Moeniralam等也发现门静脉灌注LPS可诱导出IL-6的净产生,而外周静脉灌注LPS则难以诱导肝脏分泌IL-6。推测小剂量LPS作用于肝脏时,肝脏释放了IL-6,抑制了肝脏及门静脉汇流区(肠道和脾)TNF-α的释放。经颈静脉灌注大剂量的LPS后,各静脉血中TNF-α水平而肝在1h同时达到了峰值,1h后下降