肽类物质分离提纯方法及应用

肽类物质分离提纯方法及应用

1902年，北京大学医学院的布鲁克和赫勒首次发现了促进胰激素的活性物质。因此，人们对这种活性物质的研究正在深入。世界上许多科学家正在研究活性物质。近一个世纪的研究表明，肽是由20个天然氨基酸以不同的组成和排列方式构成的二肽到复杂的线性和环形结构的不同肽类总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽广泛存在于自然界中，生物体很多活性物质都以肽的形式存在，没有肽，就没有活性，没有生命。科学家们研究发现了具有免疫调节、激素调节、酶调节、抗病毒、降血压和降血脂等功能性肽。由于功能性肽的特殊功能，使得人们对它的需求增加，现在已提取出的多种功能性肽多用于医用和保健，如功能性大豆蛋白肽已经用于降血脂。伴随着需求，人们对肽的结构和功能研究也逐渐深入。本文就近几年来肽类物质分离提纯方法及这些方法在肽类物质研究中的应用做一综述。1活性物质的溶解和提取1.1细胞破碎和固液分离由于肽源于蛋白，故应先使带有活性肽的蛋白质溶解。进行细胞破碎和固液分离是必要的，这是全过程的第1步，也是肽分离纯化阶段的重要环节，它直接影响产物的回收率，也可能影响产物的纯度。1.1.1细胞破碎和细胞制备匀浆是机体组织破碎常用方法之一。它的工原作理是通过固体剪切力破碎组织和细胞，释放蛋白质或肽类进入溶液。匀浆器有刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器和用于规模生产的压匀浆器4种。1.1.2空化现象引起肽细胞裂解输入高能超声波破碎肽组织，其工作机理是强声作用于溶液时产生气泡，气泡长大和破碎出现空化现象。空化现象引起的冲击波和剪切力使肽细胞裂解。超声波破碎在处理少量样品时，操作简便，液量损失少，适于实验应用。1.1.3控制温度和酸度酶解就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。使用此法时须根据样品细胞结构和化学组成选择适当的酶或酶系。要注意控制温度、酸碱度和酶用量。近年来，酶解法已广泛用于实验和生产。李妍和迟玉杰等人用酶法制备乳清蛋白多肽，张玲华等人用酶法制备大豆蛋白多肽。其他常用的酶解方法还有球磨法、低渗裂解法和冻融裂解法等。1.2生物活性的测定提取是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态，不丢失生物活性的过程。这一过程是将目的产物与细胞中其他化合物和生物大分子分离，即由固相转入液相，或从细胞内的生理状况转入外界特定的水溶液中。1.2.1蛋白质类、肽类等应减少或各自原螯类、肽类等蛋白抽提或肽类提取一般以水溶液为主，稀盐溶液和缓冲液对蛋白质或肽类的稳定性好，溶解度大，这是提取蛋白质或肽类的最常用的溶剂。用水溶液提取蛋白质或肽类时应注意盐溶变化、pH值和温度等对提取蛋白或肽类的影响，必要时控制这些因素，以减少杂蛋白或肽类对被提物的干扰。1.2.2稀盐、稀碱或稀碱中的有机溶剂提取一些与脂类结合较牢固、分子中非极性侧链较多的蛋白质或多肽，难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，常需用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有已醇、丙酮、异丙醇和正丁酮等。这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时它们有亲水性和亲脂性，因此常用来提取含有非极性侧链较多的蛋白质或肽类。2组分及提取物的性质采用何种分离纯化方法主要取决于所提取组分的组织材料和所要提取物的性质。对于蛋白质或多肽，提取分离方法有盐析法、超滤法、高效液相色谱法和电泳法等。2.1亲水性物质的分离纯化在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称盐析。其基本原理是：蛋白质或肽分子中的-CODH、-NH2和-OH都是亲水基因，这些基因与水相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成的1～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子间的作用力，蛋白质表面极性基因越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素是电荷和水膜，因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子或肽的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了膜，暴露出疏水区域，同时又中和电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。这是传统的分离提纯方法。盐析法的优点是操作简便，成本低廉，对蛋白质或肽有保护作用，重复性好。2.2hplc--高效液相分离HPLC是19世纪60年代末发展起来的新型分离分析技术，它的出现为肽类物质的分离提供了有利手段。近年来，HPLC被成功用来分离、鉴定和纯化合成肽等。根据样品在固定相和流动相分离过程的物理化学原理可分离附色谱、分配色谱（正相、反相）、离子交换色谱、凝胶色谱和反相色谱等。HPLC分离效果好，速度快，样品容量大，回收率高，已成为生物多肽的主要分离纯化方法。2.2.1离子交换层析IEC是以离子交换剂为固定相，根据流动相中组分离子与交换剂上平衡离子进行可逆交换时，结合力大小差异而进行分离的一种层析方法。1948年，Thompson等人首先发现离子交换现象。离子交换层析在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛。根据离子交换树脂上的交换基因所带电荷，可分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。许云禄用阳离子交换色谱法成功地分离纯化了细胞毒素———F(CTX-F）。董伟华和陈华艳等人报道用SephanseFF阳离子交换凝胶柱，成功分离了蝎毒抗癌多肽物质。2.2.2液相色谱法分离GC又称凝胶排阻色谱、分子筛层析和凝胶过滤等。这是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱法。当样品经凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到分离的目的。倪莉采用凝胶过滤色谱SephadexG-15分离纯化出丝素肽。张玲华等采用G-15葡聚糖凝胶分离了大豆多肽。2.2.3rp-hlpc分离纯化RP-HLPC分离肽的机理取决于一系列的相互作用———硫水效应，氢键形成及溶质分子中带电荷支链与硅胶的作用等。利用RP-HLPC分离多肽，首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况，为了获得一系列的保留系数，Wilce等人对2106种肽保留性质与结构进行分析，得出不同氨基酸组成与保留系数的影响关系。由于其特殊优点，此法在近年来肽的分离提纯中得到广泛应用。RP-HLPC主要用于分子量低于5000，尤其是10000以下的引性小分子肽的分离纯化。Boyes等人报道了用连续RP-HLPC对细胞原液中的组淀粉状蛋白前体多肽片进行的分离，白泉等人报道了用RP-HLPC以化学合成的32肽和21肽进行分离和纯化。2.2.4层析分离方法AC是利用连接在固定相基上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。对多肽类物质分离，目前主要应用其单抗或生物摸拟配基与其亲和，这些配基有天然的，也有人工合成的。Patel等人利用一系列亲和柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。2.3电泳法2.3.1缓冲溶液和蛋白分离CZT分离多肽类物质的主要依据是根据不同组分中的化合物所带电性决定，当毛细管缓冲溶液向负极流动，形成电渗流（EOF），溶液中正粒子也流入负极，首先流出毛细管。中性粒子随缓冲溶液流动，带负电粒子与EOF流向相反，最后流出毛细管。随着离子电荷多少和离子半径大小等因素的不同，离子迁移速度也有不同，故流出毛细管的顺序便出现差异，从而使样品得到分离。目前，CLD在蛋白质和多肽分析中已广泛被人们采用。Henkh等人采用高pH值的缓冲液分离蛋白质，理论塔板数达到1×106。Gordon等人利用在CZF在pH值10.0的硼酸盐缓冲液中成功分离了血清蛋白质。Dessi等人采用CZE技术对MAP8和MAP8结构相似的肽进行了分离。2.3.2ph梯度电泳槽CIEF工作原理是，根据不同蛋白质和肽类物质等电点（PI）不同，在具有不同pH梯度的电泳槽中，它们可在等电点pH条件下聚集沉淀下来，从而达到分离和分析蛋白质或多肽的目的。CIEF一般用于多肽混合物中各组分等电点的测定，以便为离子交换色谱提供参考数据。2.3.3结合剂的分离CGE是基于分子筛原理，经十二烷基磺酸钠（SDS）处理的蛋白质或肽类，在电泳过程中主要靠分子形状和分子量不同而分离。目前，又有一种交联、线性和疏水多聚凝胶柱被用于肽物质的分析分离，此电泳法适于含硫水侧链较多的肽类分离，这种凝胶易于灌注，使用寿命长，性质较为稳定。牛美娟和李芳等人报道了用CGE电泳与凝胶层析结合，成功分离了神经肽注射多肽成分。3毛细管电泳技术及hpce随着生命科学和生物工程技术的迅速发展，人们对多肽等生物分子的研究兴趣日益增强，尤其是对活性多肽物质的兴趣更高，其应用也日益增加。生物活性多肽的存在相当广泛，关键是如何找到最佳的提取分离方法，因而涉及它们的分离和分析问题也日益重要。随着HPLC及HPCE的制备技术、分离机制和仪器设备的不断研究和发展，相信不久的将来，会建立一套完整的多肽类物质的分离和提纯技术，并且这一技术会向快速、灵敏及高自动化方向发展，以满足科研及生产的需要。电泳就是利用在电场作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质，以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离