实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白

中国海洋大学实验报告2013年11月09日姓名：郭沈杰年级专业：2012级生物科学同组者：蔡萍萍学号：12050011012实验五醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白一、实验目的掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。二、实验原理蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH<PI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离集团不同，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。 本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。 血清中含白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等。其等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。三、实验仪器1、

牛血清 2、

醋酸纤维薄膜 3、

镊子 4、

电泳仪 5、

电泳槽 6、

盖玻片四、实验试剂1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。2、

染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。3、

漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。五、实验步骤1、准备：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。2、点样：取盖玻片一块，用玻璃棒将血清均匀的涂在盖玻片的一端面上，直直的在薄膜一端1/3处点样。3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A,通电60分钟。4、

染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液（回收）中10分钟，进行染色。5、漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，在浸入蒸馏水中。6、图谱观察：观察图谱，将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。注意事项：1、醋酸纤维薄膜在光下面能明显区分有光泽面和无光泽面；2、电泳槽中间为正极，两端为负极；3、染色液用完后回收到原来的试剂瓶中；4、漂洗薄膜时，做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂几次，既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。六、实验结果电泳结果如下七、实验分析1、醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白的原理：蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH<PI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状的不同，在电场中的迁移速度不同，故可用电泳法将其分离。2、电泳注意事项：电泳时需要注意电流和电压的控制，以及电泳时间。根据图谱分析可以估算血清中蛋白质的相对含量。图谱中颜色的深浅和面积大小可以反应血清蛋白质的含量，颜色较深者含量高，面积较大者含量高。由于电离时间等因素的影响，实验存在一定的误差。3、生物化学醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的试验中，如果区带的分离效果不好，可能存在的影响因素：1.电泳时间不足2.薄膜在染色或漂洗时重叠紧密且时间很长3.薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足4.点样时薄膜上是否存在多余的水分...4、用醋酸纤维薄膜法可以将血清蛋白质分为哪几个区带可分5条带，分别为：α1—球蛋白、α2—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白、白蛋白。可能分子量越小，带电量越高，运动速度越快。而这五种蛋白的分子量不同，带电量也不同，在电泳时的速度有快有慢。八、思考题1、影响醋酸纤维薄膜电泳的因素有哪些，其是如何影响的？血清变质：条带数会有偏差。巴比妥溶液PH不合适：影响电泳速率。漂洗次数过多或时间过长：看不清楚条带。点样没点好浓度不均或者条带模糊。2、实验过程中哪些操作会影响到实