温度、光照强度和ph对4株雨生红球藻光合作用和生长繁殖速率的影响

温度、光照强度和ph对4株雨生红球藻光合作用和生长繁殖速率的影响

雨生红球藻（cysts）的厚壁酪氨酸（cysts）可获得大量经济价值很高的红色素（astack）（grungetal.1992；李子，1991）。虾青素在珍稀水产品[主要是鲑鳟鱼类(Salmons)]养殖中被广泛用作饵料添加剂,不仅具有很好的着色效果,可以改善产品的色泽和品质,而且能增强水产品对疾病的抵抗力(Toddetal,2000;Benemann,1992;Fossetal,1984;Kranzfelder,1994)。虾青素的抗氧化能力强于β-胡萝卜素和维生素E(Tero,1989;Miki,1991),被称为“超级维生素”,具有潜在的医用价值。利用雨生红球藻大量生产虾青素已成为国际上微藻生物技术研究的热点之一。目前,国内外对雨生红球藻的研究主要集中在两个方面:(1)环境条件对雨生红球藻生长繁殖的影响;(2)环境条件对雨生红球藻孢子积累虾青素的影响,以及人工诱导虾青素的方法。在环境条件对雨生红球藻生长繁殖的影响方面,各项研究在取得共识的同时也存在较大的分歧。温度、光照、pH是影响微藻生长繁殖、生物量积累以及次生物质代谢的重要条件(王正方等,2001;颜天等,2002;刘建国等,2002)。关于最适温度,Harker等(1995)报道雨生红球藻的最适温度为14—15℃;Lu等(1994)认为最适温度为25—28℃,当环境温度高于28℃则其生长受到抑制;Borowitzka等(1991)认为其生长温度不能超过28℃,否则会促进胶群体细胞和静孢子形成;而张京浦等(1997)研究认为温度在33℃左右为宜。殷明焱等(1998)实验结果证明20℃左右生长比较好,超过28℃细胞由游动变为不动。关于最适光强,Boussiba等(1992)认为有利于其生长的光强为85—120μmol/(m2·s),最适光强为85μmol/(m2·s),当光强升到170μmol/(m2·s)时会有大量虾青素积累;Lu等(1994)认为雨生红球藻的饱和光强为90μmol/(m2·s),光强超过130μmol/(m2·s)则强烈抑制雨生红球藻的生长;Harker等(1995)认为适合生长的光强范围为50—60μmol/(m2·s),而对于虾青素积累的最适光强为1600μmol/(m2·s)。后来Harker等(1996)又进一步研究表明低光强下[<37μmol/(m2·s)]雨生红球藻细胞的成活率相当高,并且也能获得高的生物量。金传荫等(1996)认为60μmol/(m2·s)的光强接近最适光强,但张京浦等(1997)认为光强控制在160—320μmol/(m2·s)对其生长有利。作者以4株雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)为材料,研究温度、光照强度和pH对其光合作用和生长繁殖速率的影响,以期一方面了解它们的最适温度、最适光强和最适pH,加深对雨生红球藻生长繁殖与环境条件的关系的认识;另一方面通过比较4株雨生红球藻光合作用特性以及对培养温度适应性,为筛选适合于大量培养生产虾青素的藻种以及大规模培养条件的优化提供依据。1材料和方法1.1酶活剂Haematococcuspluvialis26、Haematococcuspluvialis30、Haematococcuspluvialis34和HaematococcuspluvialisWZ由中国科学院武汉植物研究所经济微藻藻种库提供。1.2培养基培养基为改良的BG11培养基。1.3繁殖条件4株雨生红球藻藻种长期保存在温度为(22±1)℃、光照强度为50μmol/(m2·s)的环境中,生长良好。1.4海藻溶液ph值的测量采用便携式pHB-4型pH计(上海雷磁仪器厂)测定藻液的pH值。1.5海藻溶液od值的测定采用722型可见光分光计(上海第二分析仪器厂)在540nm波长下测定藻液的OD值,比色杯光径为1cm。1.6光明强度的测量用LX-1332型照度计(日本三菱仪表)测定。1.7光合放氧速率法lbc采用本实验室组装的溶解氧测定系统测定藻液的净光合速率。系统由具有温度自动补偿功能的RSS5100型便携式溶解氧测定仪(上海雷磁仪器厂)、带夹层的玻璃反应杯、磁力搅拌器、LKB2219multitempⅡ恒温循环水浴(瑞典LKB)和6组荧光冷光源组成。光照强度调节范围为0—800μmol/(m2·s);藻液在磁力搅拌器的作用下持续运动;直接读取每分钟溶解氧的变化值(mg/L),计算藻的净光合放氧速率。测定光合放氧速率,通常采用μmolO2/(mgChl-a·h)为单位。本项研究的目的除了研究温度、光照强度和pH对4株雨生红球藻光合作用的影响,了解它们的最适温度、光饱和点和最适pH外,还要比较4株雨生红球藻在各自最适条件下的光合作用速率,为藻种筛选提供依据。由于4株雨生红球藻的Chl-a占鲜重的比例差异非常大,为了进行相互比较,没有采用μmolO2/(mgChl-a·h)为单位,而是以藻的鲜重为基础计算光合作用速率,单位采用μmolO2/[mg(FW)·h],更能反映藻细胞光合作用的能力。1.8弃清液上清液法吸取一定体积的藻液,以4000r/min离心5min,弃去上清液。收集藻泥,先在55℃条件下烘干2h,再在105℃条件下烘干至恒重,精确称量,计算每升藻液中藻的干重,按鲜藻含水量90%换算每升藻液中藻的鲜重。1.9光合速率测定离心收集处于对数生长期的藻,将藻液浓度调为OD540=0.3,在光照强度为100μmol/(m2·s)条件下,测定温度为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃时的单位时间内藻液溶解氧浓度的变化,计算净光合速率,绘制光合速率随温度变化的曲线。净光合速率{μmolO2/[mg(FW)·h]}=[ΔDO(mg/L)×1000]/[32×FW(mg/L)×t(h)]1.10光合速率测定离心收集处于对数生长期的藻,将藻液浓度调为OD540=0.3,在其最适温度下,测定光照强度为60、100、150、200、250、300、400、600、800μmol/(m2·s)时单位时间内藻液溶解氧浓度的变化,计算净光合速率,绘制光合速率随光强变化的曲线,计算公式见1.9。1.11光合速率的测定离心收集处于对数生长期的藻,将藻液浓度调为OD540=0.3,将藻液的pH值分别调为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,在黑暗中放置12h,然后在最适光照强度和最适温度条件下,测定各个pH值时单位时间内藻液溶解氧浓度的变化,计算净光合速率,绘制光合速率随pH变化的曲线,计算公式见1.9。1.12温度对藻液生长的影响以对数生长期的红球藻为藻种重新接种,藻液密度为(0.5—1.0)×104个/ml,50ml的三角瓶放25ml藻液,每组二个重复,置于摇床上,摇床转速为100r/min,连续光照,光照强度100μmol/(m2·s),温度根据实验要求分别设定为10℃、15℃、20℃、25℃、28℃。共培养5天,根据下列公式计算生长速率(μ):μ=(lnN2−lnN1)/(T2−T1)μ=(lnΝ2-lnΝ1)/(Τ2-Τ1)1.13光照强度和光照周期以对数生长期的红球藻为藻种重新接种,接种密度为5.5×104/ml,50ml三角瓶装25ml藻液,分为两组,一组连续光照,光照强度为50μmol/(m2·s),另一组光暗周期为L∶D=12h∶12h。每隔24h取样记数,绘制生长曲线,计算生长速率,计算公式与1.12相同。2结果2.1光合放氧速率结果如表1所示。在实验条件下,H.pluvialis26在5℃时光合放氧速率低,当温度升高到15℃时,光合放氧速率达到最大值;在10—20℃范围内,光合放氧速率基本保持稳定;温度超过20℃,光合放氧速率直线下降,35℃时,光合放氧速率只有最大值的1/5。H.pluvialis30的光合放氧速率变化与H.pluvialis26的基本相同,随着温度的升高,经历了一个直线上升—基本稳定—直线下降的过程,20℃时,光合放氧速率最大;35℃时,光合放氧速率只有最大值的1/4。H.pluvialis34在5—15℃范围内,光合放氧速率直线上升,15℃时达到最大值;15—35℃范围内,光合放氧速率直线下降,35℃时,光合放氧速率已成为负值。H.pluvialisWZ的光合放氧速率变化与H.pluvialis34的很相似,但是其光合放氧速率的最大值出现在10℃时,比其他3个藻种的温度都低。2.2光饱和水溶液比结果如表2所示。在实验条件下,4株雨生红球藻的光合放氧速率随光照强度变化具有非常相似的特征:在低光强时,光合放氧速率随光照强度的增大而直线上升,当光强达到光饱和点,光合放氧速率达到最大值,光强超过光饱和点,光合放氧速率不再随光照强度的增大而上升,而是基本保持稳定。H.pluvialis26的光饱和点最高,为250μmol/(m2·s);H.pluvialis30和H.pluvialis34的光饱和点均为200μmol/(m2·s);H.pluvialisWZ的光饱和点最低,为150μmol/(m2·s)。2.3光合放氧速率随时间的变化如表3所示,在实验条件下,4株雨生红球藻的光合放氧速率随pH变化分为两种类型:(1)随着藻液pH值的上升,光合放氧速率经历了一个上升—最大值—下降的过程;(2)随着藻液pH值的上升,光合放氧速率持续下降。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34属于第一种类型,H.pluvialisWZ属于第二种类型。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的最适pH值分别为8.0、8.0和7.0,H.pluvialisWZ的最大光合放氧速率出现在pH6.0处。当pH值达到12时,4株雨生红球藻的光合放氧速率均降为负值。2.4培养生长速率H.pluvialis26、H.pluvialis30、H.pluvialis34和H.pluvialisWZ在不同温度下培养的生长速率见表4,它们分别在20℃、25℃、20℃、15℃时生长繁殖最快。2.5胞密度和计数光暗周期对4株雨生红球藻生长繁殖速率具有相似的影响。H.pluvialisWZ在连续光照和12h光照12h黑暗条件下培养,细胞密度的变化见表5。H.pluvialisWZ在连续光照和12h∶12h光暗周期的条件下培养,细胞数目的变化有显著差异。经过4天的培养,在连续光照下,每毫升藻液中的细胞数目增加了11.6×104;而在12h∶12h光暗周期条件下,每毫升藻液中的细胞数目仅增加了5.0×104,前者的增加量是后者的2倍多;对应的生长速率(μ)分别为0.284和0.162,前者是后者的1.75倍。3讨论3.1适应低温的品系实验结果表明,温度、光照、pH对雨生红球藻光合作用有显著的影响,不同的藻种(品系),光合作用的最适温度、最适光强和最适pH不同。本实验中所用的4个品系,H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的光合作用特性比较相似,而H.pluvialisWZ则显著不同。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34在10—20℃范围内,都表现出活跃的光合作用,属于适应低温的品系。H.pluvialisWZ的最适温度为10℃,温度超过10℃,光合放氧速率随温度的升高而几乎直线下降,表现出对低温特异的适应性,与迄今为止所报道的雨生红球藻都不同。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的最适pH为中性和弱碱性,与其他研究者的报道相同(邱保胜等,1999;Elliott,1934)。而H.pluvialisWZ的最适pH为弱酸性和中性,也是比较特殊的。除了光饱和点不同外,实验所用的4个品系的光合放氧速率随光照强度的变化具有基本相似的特征,值得注意的是,虽然4个品系的光饱和点都不高,但是,光强升高到光饱和点的4—5倍,光合放氧速率并没有下降,即没有出现高光抑制现象。根据这一点,作者推论,雨生红球藻并不像普遍认为的那样对高光敏感(刘建国等,2000),实际上具有较强的耐高光能力。3.2测定适合于不同品系的最适培养温度雨生红球藻生长繁殖速率随培养温度升高的变化与光合作用随温度的变化具有相同的趋势,都经历了上升—最大—下降的过程。光合作用的最适温度低的品系,培养的最适温度也低,反之亦然。有意思的是,4个雨生红球藻品系的最适培养温度都比其光合作用的最适温度高5℃。现在还不清楚这一现象只是所研究的4个品系的巧合,还是雨生红球藻的特性。从理论上分析,同一藻种(品系)的最适培养温度与光合作用的最适温度密切相关,光合作用表现出的温度适应性反映生长繁殖对温度的要求。所以,可以通过测定适合于光合作用的温度来了解藻种(品系)适合的培养温度。测定光合作用速率随温度的变化,方法简便、省时、省力,可以快速地对大量样品进行检测。这一方法已经在作者的实验室中成功地用于高温和低温螺旋藻品系的筛选。细胞数目的增加与光照时间成正比,表明雨生红球藻不需要光暗周期变化。在培养中,为了使藻快速生长繁殖,大量积累生物量,增加光照时间是有效的手段。3.3有潜力的耐低温藻种的筛选筛选适合于大量培养的雨生红球藻,首先应该选光合放氧速率高,生长繁殖快的藻种。比较4个品系在各自的最适条件下的光合放氧速率和在不同温度下培养的生长速率,除H.pluvialis34外,其余三个品系的表现都较好,并且各有特色。H.pluvialis34的光合放氧速率较低,特别是表1反映出其温度适应范围很窄,10℃时出现负增长,仅在15℃和20℃范围内生长较快,温度超过25℃,生长速率明显下降,不适合作为大量培养的藻种。H.pluvialis26的适应范围最广,综合表现最好,是一个有潜力的藻种。H.pluvialisWZ是一个特性鲜明的藻种,从其光合作用随温度变化的特性看,是一个特别适应于低温的藻种。由于雨生红球藻普遍适应于较低的培养温度,最适温度一般在20℃左右,为了进行大规模生产,筛选藻种的注意力一