蓖麻粗毒的提取及其药效成分和药效研究

蓖麻粗毒的提取及其药效成分和药效研究

氨基乙醇钠对所有哺乳动物的真核细胞都有毒性作用，ld50为7,10）g，kg。在防治草原鼠害中具有较好的应用前景。我们于2005～2006年对蓖麻粗毒的分离、提取及活性进行了初步实验研究。1实验动物及试剂蓖麻籽为市售,去壳后4℃保存;实验用昆明种小白鼠(体重20g左右)由四川大学实验动物中心提供;匀浆机、冷冻离心机、旋转蒸发器、真空干燥器、1ml注射器、蒸馏水、透析袋均购自四川大学设备处;(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4等均为国产分析纯。2单次给药、细注射参考Nicolson等的方法,对提取条件进一步研究,以小鼠是否死亡为指示,寻找提取蓖麻粗毒的最优途径。小鼠活性实验设计:①对浸提后的混合物4000r/min离心30min,小心除去油脂,保留清液,提取离心所剩的渣滓,每种渣滓再用对应的浸提液浸泡24h。分别进行4000r/min离心30min,小心取出油脂,保留清液,得到对应的粗毒溶液;②对盐析后的混合物10000r/min离心30min,保留沉淀,取上清液。以上述浸提和盐析两种方式获得的溶液做原药,分别取1ml稀释后腹腔注射小鼠(剂量为每鼠0.5ml),每组每浓度用5只小鼠,并取1只小鼠做空白对照。以小鼠死亡率最低的那组即是粗毒提取效果最佳的。每一实验重复3次。2.1实验a：提取物的选择和提取物条件的讨论2.1.1方法匀浆和浸提液制备分别称取50g脱壳蓖麻籽,依次分别用100ml的水、100ml0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)和100ml5%乙酸溶液进行匀浆,再静置于4℃环境中浸提24h。对浸提后的混合物4000r/min离心30min,小心除去油脂,保留清液,提取离心所剩的渣滓,每种渣滓再用对应的浸提液浸泡24h后,分别进行4000r/min离心30min,小心取出油脂,保留清液,得到对应的粗毒溶液作小鼠活性实验。合成条件2、48h分别称取50g脱壳蓖麻籽,用上述3种的浸提剂100ml匀浆,于4℃浸提12、24、36、48h。对浸提后的混合物4000r/min离心30min,小心除去油脂,保留清液,提取离心所剩的渣滓,每种渣滓再用对应的浸提液浸泡24h后,分别进行4000r/min离心30min,小心取出油脂,保留清液,得到对应的粗毒溶液作小鼠活性实验。各浸提剂最佳浸提时间的确定分别称取50g脱壳蓖麻籽,加入100ml、150ml、200ml的上述3种的浸提剂匀浆。于4℃浸提至各种浸提剂对应具有最佳蓖麻粗毒浸提效果的时间。对浸提后的混合物4000r/min离心30min,小心除去油脂,保留清液,提取离心所剩的渣滓,每种渣滓再用对应的浸提液浸泡24h后,分别进行4000r/min离心30min,小心取出油脂,保留清液,得到对应的粗毒溶液作小鼠活性实验。清液盐析浓缩法分别称取50g脱壳蓖麻籽,各自加入适量的浸提剂匀浆,4℃浸提适宜时间。所得混合物4000r/min离心30min,小心除去油脂以及离心所剩的渣滓,保留清液,在清液盐析24h后,10000r/min离心30min,收集沉淀,沉淀溶解于蒸馏水中,透析24h,将透析所得40℃减压蒸馏,最后真空干燥可得蓖麻粗毒。从而可计算各自的产率。2.1.2结果与分析缓冲液的浸提效果结果表明,0.2mol/L的磷酸缓冲液的浸提后再次浸泡提取液的杀鼠效果最低,说明0.2mol/L的磷酸缓冲液的浸提效果最好(表1)。最佳浸提时间的确定由于选择3种不同的浸提剂,故按照浸提剂分组,组内进行实验最后综合对比得出结果。同时最终只选择3个浓度梯度的药物做活性实验。显然,水做浸提剂时浸提36h的杀鼠效果最低,说明此时水已经把绝大多数的蓖麻毒素浸提出来,导致渣滓里的蓖麻毒素含量很低,所以再次浸提后的杀鼠效果最低,从而说明36h是水的最佳浸提时间(表2);5%乙酸浸提剂浸提24h的杀鼠效果较低,浸提36h后的杀鼠效果区别很小,故24h是5%乙酸做浸提剂时的最佳时间(表3);0.2mol/L的磷酸缓冲液浸提24h的杀鼠效果较低,浸提36h后的杀鼠效果区别很小,同理,24h是0.2mol/L的磷酸缓冲液做浸提剂时的最佳时间(表4)。最佳质量体积比的确定由于选择3种浸提剂,故按照浸提剂分组,组内进行实验最后综合对比得出结果。同时基于方便的考虑,只选择3个浓度梯度的药物做活性实验。结果表明,水做浸提剂时,蓖麻籽与水的质量体积比为1∶3(g/ml)时,再次浸泡提取液的杀鼠效果较低,说明质量体积比为1∶3(g/ml)的效果较好,同理1∶4时的效果最好,但是由于加入的浸提液越多,最终加入的盐析剂就越多,而且1∶4浸提时的灭鼠效果并无显著提高,所以出于经济方便的考虑,选择1∶3为最佳质量体积比(表5);5%乙酸做浸提剂时,蓖麻籽与5%乙酸的质量体积比为1∶2(g/ml)时,再次浸提液的杀鼠效果最低,说明质量体积比为1∶2(g/ml)的效果最好(表6);0.2mol/L的磷酸缓冲液做浸提剂时,质量体积比为1∶3(g/ml)时,再次浸泡提取液的杀鼠效果最低,说明质量体积比为1∶3(g/ml)的效果较好,同理1∶4时的效果最好,但是由于加入的浸提液越多,最终加入的盐析剂就越多,而且1∶4浸提时的灭鼠效果并无显著提高,出于经济方便的考虑,所以选择1∶3为最佳质量体积比(表6)。出于经济和方便的考虑,并结合相关文献,确定pH7.2左右可作为最适合浸提,在此不再讨论。最佳浸提剂的确定由结果不难看出,只有0.2mol/L的磷酸缓冲液在同样条件下所得蓖麻毒素(粗毒)产率最高(表8),同时提取路线还兼顾到蛋白的稳定性及经济性,正是要寻找的最佳浸提剂。2.2实验b：盐析剂的选择和最佳盐析条件的探索2.2.1不同盐析剂对小鼠的盐析活性实验称取50g脱壳蓖麻仔,加入150ml0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2)匀浆,4℃浸提24h。所得混合物4000r/min离心30min,小心除去油脂以及离心所剩的渣滓,保留清液,在清液中分别加入不同的盐析剂,每种盐析剂分别加到50%、60%、70%、80%饱和度,盐析24h后,10000r/min离心30min,观察现象,收集沉淀,然后对所得的每种上清液取1ml,稀释1000倍,做小鼠活性实验,最终小鼠未死亡或死亡最少的那组即是盐析效果最佳的。2.2.2结果与分析从表9可知,80%饱和度的(NH4)2SO4盐析后的上清液杀鼠效果最低,说明80%饱和度的(NH4)2SO4盐析效果最好。2.3实验c：确定厚毒有用程度2.3.1ld50的制备称取50g脱壳蓖麻仔,加入150ml0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2)匀浆,4℃浸提24h。所得混合物4000r/min离心30min,小心除去油脂以及离心所剩的渣滓,保留清液,在清液中加入(NH4)2SO4到80%饱和度,盐析24h后,10000r/min离心30min,收集沉淀,然后对所得的沉淀用蒸馏水透析24h。将透析所得40℃减压蒸馏,最后真空干燥可得粗毒。称取一定量的粗毒,溶于100ml水中煮沸。放凉后取1ml以10倍稀释法配制腹腔注射用药,做小鼠活性实验。用未煮沸的粗毒做活性实验,可求得LD50。小鼠随机分为5组,每组5只,按低比稀释法配制不同剂量的药液,每组分别给药,记录注射剂量、小鼠死亡时间,共观察96h。LD50计算方法为寇氏法。2.3.2糖液毒蛋白的急性毒性实验结果结果蓖麻粗毒制成水剂后煮沸,其中毒蛋白(含血球凝集素)被破坏,注射药剂中有效成分仅为蓖麻碱和变应原,蓖麻碱的毒性较弱,变应原无致死作用。由实验结果看出毒蛋白遭破坏后的杀鼠性能显然比未被破坏的对照组要低得多,而血球凝集素的毒性仅为蓖麻毒蛋白的1/10(表10)。从而说明蓖麻粗毒的主要药效成分为蓖麻毒蛋白。求得LD50=7.971μg/kg,S=0.0548μg/kgLD50的95%平均可信限为7.971±1.281μg/kg3投毒投毒试验2006年3月中旬,在四川省阿坝州若尔盖县热尔乡进行了野外灭鼠试验。当地平均海拔3500m,气温-3～10℃。灭鼠对象主要为高原鼠兔。将蓖麻粗毒制成的灭鼠剂用水稀释后拌取饵料,以饵料重量计配成1%浓度的毒饵,人工投饵,在5万亩投饵区内随机划定6个半径为28.2m的圆形样方,样方间隔在50m以上,并设2个清水对照。投药前调查样方内的有效洞数,方法为堵洞盗洞法。投毒后6天检查有效洞数,计算灭效,结果如表12。大面积实验的校正灭效为85.41%,实验区内高原鼠兔活动明显减小,灭杀效果比较明显。4实验结果与分析实验以灭鼠为目的,对蓖麻毒素(粗毒)的提取路线进行优化选择,研究了提取粗毒的杀鼠活性,并进行了大面积野外灭鼠试验。结果表明,使用优选的蓖麻毒素提取方法,