中国人合并并多发性趾畸形家系中hoxd13基因突变的检测

中国人合并并多发性趾畸形家系中hoxd13基因突变的检测

此外，脚趾也是一种由相邻的脚趾（脚趾）组成的畸形。这是人类常见的下肢畸形之一。根据受累指(趾)的差异,可将非综合征性并指(趾)畸形分为Ⅰ～Ⅴ型。Ⅱ型并指(趾)为常染色体显性遗传的并多指(趾)畸形(synpolydactyly,SPD,MIM186000)。典型SPD表现为3/4并指及4/5并趾,蹼中的第4指及第5趾部分或完全多指(趾);SPD具有外显不全和表现度不一致的特点。1996年,Muragaki等发现位于染色体2q31区域的HOXD13基因在3个美国SPD家系的患者中发生多聚丙氨酸链延展(polyalanineexpansion,PAE)突变,确定HOXD13为SPD的致病基因,并首次揭示PAE作为一种新的突变机制在遗传病发生中的重要作用。正常HOXD13蛋白含一个由15个丙氨酸残基组成的多聚丙氨酸链(polyalaninetract,Poly-A);而在迄今为止国外已鉴定的26个SPD家系的患者中,Poly-A则延展为22～29个丙氨酸残基。我们发现一个中国人SPD大家系,进行了表型、HOXD13基因突变和产前基因诊断研究。1对象和方法1.1知情同意接受检查的9名患者的x射线审查中国山东地区的一个SPD大家系。该家系共4代54人;其中患者16人,现存患者15人(图1)。我们对该家系中全部成员进行了表型调查。在知情同意接受检查的9名患者中,5名已行手或足整形手术(Ⅲ14,Ⅳ5,Ⅳ6,Ⅳ9和Ⅳ11)。对先证者(Ⅲ14)双手和另外3名患者(Ⅱ3,Ⅲ9和Ⅲ18)双手足行正位X光检查。先证者之女(Ⅳ9)术前双手足X光片也用于表型分析。1.2方法1.2.1基因组dna提取在获知情同意后,采集家系成员外周血18份(2～6ml/人),其中患者血样9份。常规酚氯仿法提取基因组DNA。应先证者要求,采集第1次怀孕17周羊水和第2次怀孕8周绒毛组织,常规提取基因组DNA。1.2.2pcr扩增及测序针对HOXD13第1外显子的序列,设计并合成一对特异引物,经PCR扩增编码Poly-A的GCN重复序列及两侧序列。引物顺序为5′-CTTTCTCTCCGCGCCTGTGTTCG-3′和5′-CTACAACGGCAGAAGAGGACGACG-3′,扩增片段161bp。应用PTC-200热循环仪(MJ)进行PCR反应。在50μl反应体系中,加GC缓冲液Ⅱ25μl,2.5mmol/LdNTP8μl,10μmol/L引物各2μl,LATaq聚合酶(大连宝生物工程有限公司)2.5U,基因组DNA模板1μl(50ng/μl)。PCR反应条件为94℃预变性3min;94℃30s,65℃30s,72℃30s,35个循环;72℃延伸8min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。按厂家推荐方法将PCR片段克隆到pDM18T载体并进行阳性克隆的插入片段测序(大连宝生物工程有限公司)。1.2.3dna模板pcr扩增HOXD13内PAE检测以先证者、先证者配偶、先证者女儿以及羊水和绒毛DNA为模板,按上述方法进行扩增。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。1.2.4微卫星多态标记的构建选取HOXD13内含子内CA重复序列及HOXD13两侧微卫星多态标记D2S2981和D2S2314,通过PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染进行等位基因分型和单体型分析。2结果2.1伴中小型spd的表型特征在本家系4代54人中,患者16人(男6人,女10人)。图1所示系谱符合常染色体显性遗传方式。通过家系成员表型调查和X光检查,我们发现所有患者畸形仅限于手足(图2)。同时,家系中患者表型复杂,存在明显的表现度变异,不同患者间以及同一患者不同手、足间表型差异显著。患者共同表现为:单侧或双侧3/4并指和4/5并趾,伴蹼内部分或完全多指(趾),符合典型SPD的表型特征。但家系中患者手足畸形的严重程度不同,畸形谱的范围较广。先证者(Ⅲ14)3/4并指限于右手(图2a和e);2人(Ⅲ9和Ⅳ6)表现单侧4/5并趾(图2k和o);1人无并多趾,仅有双侧第5趾短小(Ⅳ5);4人(Ⅱ3,Ⅲ9,Ⅲ14和Ⅳ9)呈双侧第5指弯曲(图2a、b、c、e、f、g和i)。X光检查还显示,3/4并指蹼内赘生指骨发育不良,5人中4人(Ⅱ3,Ⅲ9,Ⅲ14和Ⅳ9)表现为第4指近节指骨基部分支与第3指掌/指关节相连成“桥”状结构(图2e、f、g和i)。先证者(Ⅲ14)及其父亲(Ⅱ3)第4指远节指骨分叉(图2e和f);先证者女儿(Ⅳ9)第4指近节指骨增宽或增宽分叉,中远节指骨成对(图2i)。先证者堂兄(Ⅲ18)3/4并指蹼内仅表现3、4指远节指骨间的融合(图2h)。先证者无术前足X光检查资料用于分析,在可供分析的4人中,3人(Ⅲ9,Ⅲ18和Ⅳ9)完全骨性多趾并有第4跖骨分叉或成对(图2m,n和p),1人(Ⅲ9)单侧第5趾趾骨畸形而无多趾(图2o)。2.2poli-a编码及序列检测对18名家系成员的HOXD13第1外显子内GCN重复序列进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示:9名手足正常者出现161bp的单一条带,而全部9例患者除161bp条带外均有一个额外的长片段。克隆PCR扩增片段并测序,发现患者中Poly-A编码序列内多出9个GCN重复单位共27bp(图3)。此PAE突变导致Poly-A的丙氨酸残基由正常的15个延展成24个,PCR扩增片段相应增长为188bp。2.3携带突变基因的危险因素分析先证者连续两次怀孕,分别提供羊水和绒毛标本用于产前诊断。图4示产前HOXD13内PAE突变检测结果。羊水和绒毛标本DNA同样可检出161bp和188bp两个条带,提示胎儿携带突变基因。为排除孕妇细胞污染羊水和绒毛的可能性,我们利用HOXD13内及该基因两侧共3个微卫星多态标记进行了单体型分析。图5结果表明:羊水和绒毛标本DNA仅存在母源突变HOXD13等位基因而无母源野生型HOXD13等位基因。因此,羊水和绒毛标本DNA源自胎儿细胞,先证者连续两次怀孕胎儿(F1和F2)肯定携带突变HOXD13等位基因。其中F1在先证者引产后得到确认。3spd家系基因型ppd和pole-a突变SPD是一种罕见的常染色体显性遗传病,其致病基因为HOXD13。HOXD13含有两个外显子,5′端第1外显子含有编码Poly-A的GCN(N为A、C、G或T之一)非完全三核苷酸重复(imperfecttripletrepeats)序列,3′端第2外显子编码高度保守的同源盒结构域(homeoboxdomain),内含子中存在一CA重复序列(图6)。自Muragaki等发现HOXD13基因PAE突变是SPD发生的遗传基础以来,国外共在26个SPD家系中检出这种新的延展突变。典型SPD的表型特征包括:3/4并指及4/5并趾,蹼中的第4指及第5趾部分或完全多指(趾)。国外研究资料已显示,绝大多数典型SPD病例的致病突变都为HOXD13基因PAE。HOXD13基因内微小缺失和点突变(图6)可引起非典型SPD或短指(趾)畸形(D和E复合型)。我们报告的中国人SPD大家系中,患者表型符合典型SPD的特征,亦由HOXD13内PAE突变引起,与国外资料一致。HOXD13是HOX基因家族中首先被证明与人类肢端发育畸形有关的基因,也是第一个证明PAE新突变类型的基因。Warren等认为,HOXD13第1外显子内GCN非完全三核苷酸重复序列不等交换可能是PAE产生的机制。迄今为止,已在包括SPD在内的9种人类遗传病中发现致病基因的突变形式为PAE。但尚未见任何基因内Poly-A缩短引起人类遗传病的文献报告。Goodman等分析了20个典型SPD家系中表型与PAE突变的相关性,发现外显率及手足畸形严重程度与Poly-A长短(丙氨酸残基数多少)呈明显正相关。例如,17名携带7个丙氨酸延展的SPD家系成员表型正常(不外显);而携带14个丙氨酸延展的患者手足畸形严重,且可伴有尿道下裂畸形。Goodman等的结果还显示,典型SPD家系中7个丙氨酸延展和9个丙氨酸延展突变最多见,分别为40%(8/20)和35%(7/20)。我们报告的中国人SPD大家系中,PAE突变导致9个丙氨酸延展。根据18个家系成员的