响应面法优化蒙古栎叶片抗氧化活性提取工艺

响应面法优化蒙古栎叶片抗氧化活性提取工艺

蒙古阿尔特罗夫是地壳植物科的一种多年生树木，属于中国北方广泛分布的树种。然而，蒙古阿尔特资源的利用率很低，通常只使用树干来加工和使用，而叶片和其他可再生资源很少。蒙古的树皮曾被用作蚕茧和鹿饲料，但缺乏更广泛的应用方法。这些叶子通常被用作初始燃料。在实践生产过程中,由于传统合成抗氧化剂,如叔丁基-4-羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和2-叔丁基对苯二酚(TBHQ)等对人体具有毒副作用,联合国粮农和世界卫生组织食品添加剂委员会已对此类化合物的使用做出严格规定,从天然资源中寻找天然抗氧化物质已成为一种趋势。同时,研究表明蒙古栎叶片富含酚类等抗氧化物质,如张国友等证实蒙古栎叶片内含有丰富的酚类物质,并研究了其抗氧化能力对生态学的意义;王耀辉等对蒙古栎叶片中挥发性成分进行了分离和鉴定,其鉴定的蒙古栎叶片中均含有酚类物质;Ishimaru等从蒙古栎叶片中分离出酚苷物质,如D-threo-guaiacylglycerol-8-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,L-threo-guaiacylglycerol-8-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,3-methoxy-4-hydroxyphenol-1-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,gentisicacid5-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenol1-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,cis-coniferylalcohol4-O-β-D-(6′-O-galloyl)-glucopyranosides等。因此,研究蒙古栎叶片中酚类等抗氧化物质提取工艺及其优化具有实际应用价值和意义。超声辅助提取是近年来发展起来的新型、高效、避免高温对提取成分影响的提取技术,其广泛应用于多酚类物质的提取过程。笔者利用超声辅助提取法对蒙古栎叶片多酚提取工艺进行了优化。在单因素筛选的基础上,应用响应面法对主要影响因素进行考察,并以多酚质量和清除ABTS自由基能力双响应因子进行3因素3水平的试验设计,同时,对分离的蒙古栎多酚的抗氧化能力采用DPPH体系进行了验证,以期为蒙古栎多酚在天然抗氧化功能产品和食品抗氧化添加剂领域的进一步开发利用提供科学依据。1材料和方法1.1蒙古栎叶片制备KQ-250DB型台式数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)、HZS-HA型水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)、RE-52AA型旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)、SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、BS210S型电子天平(德国Sartorius公司)。所用蒙古栎位于黑龙江省哈尔滨市东北林业大学校内(北纬45°43.096′~45°43.097′,东经126°38.036′~126°38.037′),并经森林植物生态学教育部重点实验室(东北林业大学)聂绍荃教授鉴定,确定为目标树种。蒙古栎叶片采摘于2008年9月,自然阴干,叶片使用前粉碎并筛分,取粒径为250~850μm的叶片粉末作为试验材料。福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂、1,1-二苯代苦味酰基自由基(DPPH)、2,2-吖嗪双(3-乙基-7-苯并噻唑啉磺酸)二铵盐(ABTS)、水溶性维生素E(Trolox)、二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基-4-羟基茴香醚(BHA)、L-抗坏血酸(VC)和维生素E(VE)购自美国Sigma公司,没食子酸对照品购自中国药品生物制品检定所,其他试剂均为国产分析纯。1.2提取物多酚含量的测定采用福林酚法测定多酚质量分数,结果以每克提取物中含有相当没食子酸的毫克数来表示。以吸光度为横坐标,没食子酸质量浓度(g·L-1)为纵坐标表示,线性回归方程:y=0.270x-0.021(相关系数R=0.9964,线性范围:0.148~1.565g·L-1)。取质量浓度为1g·L-1的各提取物样品甲醇溶液1.0mL与1.0mL福林酚试剂混合,静置4min后加入1.0mL的10%Na2CO3溶液,最后用去离子水定容至25mL,室温反应2h,在波长765nm测定吸光度。各提取物样品重复测定3次,将吸光度取平均值,代入回归方程,按式(1)计算多酚的质量。Y1=c1×V1。(1)式中:Y1为多酚质量(mg);c1为多酚的质量浓度(g·L-1);V1为提取液体积(mL)。1.3abts溶液配制参照Wanwisa等的方法(略作改动)进行多酚清除ABTS自由基能力测定,其中储备液包括7.4mmol·L-1ABTS溶液和2.6mmol·L-1过硫酸钾溶液,用前将2种溶液等量混合,室温下避光反应12h,然后吸取1mL混合液用甲醇稀释54.7倍,以在波长734nm处获得的0.710±0.02吸光值,得到ABTS液。配制浓度为50~600μmol·L-1的Trolox溶液,分别取1mL不同浓度Trolox溶液加入19mLABTS溶液,室温下避光反应2h,在波长734nm处测定吸光值。根据Trolox溶液浓度和反应后的吸光度做出线性回归方程。线性回归方程:y=-0.001x+0.5994(相关系数R=0.9988,线性范围:50~600μmol·L-1)。蒙古栎样品中多酚清除ABTS自由基能力测定同2.2中多酚清除ABTS自由基能力测定方法,清除ABTS自由基能力的结果以样品中抗氧化物质的质量摩尔浓度表示,单位为mol·g-1,每样品重复测定3次,结果取平均值。1.4影响提取效果的因素测试1.4.1提取条件的确定准确称取2.0g蒙古栎叶片原料,置于50mL锥形瓶中,在选定条件下提取,以多酚质量与清除ABTS自由基能力为考察对象,确定提取因素变化范围以及各因素的适宜值。1.4.2响应面优化试验单因素试验结果显示超声提取过程的主要影响因素,包括乙醇体积分数、提取时间和液料比。以影响因素作为考察对象,采用DesignExpert7.0统计分析软件,分别以多酚质量与清除ABTS自由基能力为响应值,进行响应面法优化试验,以获取最适参数。试验因素和水平安排见表1。1.5测定sd50值参照Wu等的方法(并略作改动)进行多酚清除DPPH自由基能力测定,将0.1mL不同质量浓度的多酚样品的95%乙醇液加入3.9mL25mg·L-1DPPH的95%乙醇液中,在黑暗处放置30min后,在波长为517nm处测定吸光值,计为A样品,以4mL95%乙醇的吸光值为空白对照,清除DPPH自由基能力用SC(%)表示,SC=(1-A样/A对照)×100%,其中A对照为不加样品的溶液在t=0时的吸光值,所有吸光值均测定3次,结果取平均值,应用SigmaPlot软件拟合非线性回归曲线,得出EC50值。2结果与分析2.1影响提取效果的因素2.1.1提取时间对蒙古栎叶片中多酚含量和清除自由基能力的影响提取时间对蒙古栎叶片中多酚质量及清除ABTS自由基能力测定的影响如表2所示。随着提取时间的增加,清除ABTS自由基能力呈递增趋势,但30min后增长趋势不明显。说明提取进行30min后,提取时间对蒙古栎叶片中多酚质量与清除ABTS自由基能力的影响甚小。因此,选择20~40min为进一步优化的提取时间范围。2.1.2乙醇体积分数对abts自由基能力的影响乙醇体积分数对蒙古栎叶片中多酚质量与清除ABTS自由基能力的影响见表3。随着乙醇体积分数的增加,清除ABTS自由基能力在乙醇体积分数为30%时达到相对峰值,但当乙醇体积分数大于30%后,其变化始终处于下降趋势。因此,选择10%~50%为进一步优化的乙醇体积分数范围。2.1.3液料比对abts自由基能力的影响液料比对蒙古栎叶片中多酚质量与清除ABTS自由基能力的影响见表4。当液料比小于15mL·g-1时,清除ABTS自由基能力变化明显;而当液料比大于15mL·g-1时,随着液料比的增加,其增长趋势放缓。本着节约溶剂使用量的原则,选择10~20mL·g-1为进一步优化的液料比范围。2.1.4各组abts自由基能力比较考察提取次数对蒙古栎叶片中多酚质量与清除ABTS自由基能力的影响,结果见表5。随着提取次数的增加,清除ABTS自由基能力呈递增趋势。当提取3次后,其增长趋势不明显。同时考虑到增加提取次数,会增加溶剂的使用量,溶剂回收成本高,提取次数选择3次较合理。规模生产时亦可考虑提取3次,第3次的提取液可作为下一批次第1次提取的提取溶剂使用,以降低成本。2.2蒙古栎叶片多酚质量对abts自由基的响应响应面法试验设计组合和蒙古栎叶片多酚超声波提取响应面法试验中,17个试验点可以分为两类:一类是析因点,自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点,共有12个析因点;另一类是以零点作为区域的中心点,零点试验重复5次,用以估计试验误差。响应面法试验设计与试验结果见表6。以蒙古栎叶片中多酚质量与清除ABTS自由基能力为响应值,经回归拟合后,根据DesignExpert7.0统计分析软件中ANOVA分析,试验模型显著。具体参数见表7和表8。在各项方差分析中,当p值小于0.05时表明影响显著;p值小于0.001时表明影响极为显著。因此,在多酚质量中,C的一次项对多酚质量影响极显著;A2和B2对多酚质量影响显著(表7)。在清除ABTS自由基能力中,C的一次项对清除ABTS自由基能力的影响极显著;A2、B2和BC对清除ABTS自由基能力影响显著,参见表8。采用DesignExpert7.0统计分析软件,对多酚质量与清除ABTS自由基能力进行最优化设计,得到蒙古栎叶片多酚提取条件为:乙醇体积分数28.62%,提取时间30.90min,液料比19.96mL·g-1,提取次数为3次。2.0g蒙古栎叶片原料中多酚质量为84.88mg;ABTS自由基清除能力为0.79mol·g-1。2.3清除dpph自由基能力抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力一般用EC50值表示,即达到DPPH清除率50%时抗氧化剂的质量浓度。将蒙古栎叶片多酚样品配制成不同质量浓度的溶液,检测其对DPPH自由基的清除效果,并与4种合成抗氧化剂BHT、BHA、VC和VE的清除效果进行比较,结果见表9。经SigmaPlot软件处理后,计算出4种合成抗氧化剂BHT、BHA、VC、VE和蒙古栎叶片多酚清除DPPH自由基能力的回归曲线分别为:BHT:y=-8611.75x2+1425.1152x+6.3018,R=0.9604;BHA:y=-13245.2477x2+2160.0086x+4.6515,R=0.9893;VC:y=-14462.256x2+2291.0282x+4.8877,R=0.9891;VE:y=-8431.7396x2+1406.4228x+6.227,R=0.9607;多酚样品:y=-161.3255x2+254.0954x+0.8907,R=0.9891。不同抗氧化剂的EC50值分别为:蒙古栎叶片多酚223mg·L-1、BHA246mg·L-1、BHT406mg·L-1、VC230mg·L-1、VE414mg·L-1。可知分离的蒙古栎叶片多酚清除自由基的能力要强于合成抗氧化剂,并且蒙古栎叶片多酚质量分数与DPPH清除能力具有明显的量效关系。3蒙古栎叶片抗氧化活性的检测采用超声提取法对蒙古栎叶片多酚以多酚质量与清除ABTS自由基能力为双响应因子进行提取,在单因素试验的基础上对超声波提取过