念珠菌等酵母菌的分类鉴定

念珠菌(Candida)等酵母菌

的分类和鉴定1精选课件什么是酵母菌?Yeastsarefungiwithvegetativestatesthatpredominantlyreproducebybuddingorfission,resultingingrowththatiscomprisedmainlyofsinglecells,andwithsexualstatesthatarenotenclosedinfruitingbodies.酵母菌是主要以单细胞形式存在的真菌，以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖，有性生殖阶段不产生子实体。2精选课件致病酵母菌引起的症状及其生境3精选课件酵母菌分类95属，723种(TheYeats,aTaxonomicStudy,4thedn.,1998)AccomycetousYeasts(子囊菌酵母)Ascomycota “Archiascomycetes” Schizosacchromycetales Taphrinales Protomycetales Pneumocystidales Euascomycetes Saccharomycetales (11families)4精选课件BasidiomycetousYeasts(担子菌酵母)Teleomorphictaxa

I.With“simple”septalpores

A.Basidiacylindric,transverselyseptate

Ustilaginales Sporidiales Platygloeales Septobasidiales Atractiellales Agaricostilbales

B.Basidiaglobose,nonseptate

Graphiolales

C.Basidiacylindric,nonseptate

Cryptobasidiales Exobasidiales5精选课件BasidiomycetousYeasts(担子菌酵母)Teleomorphictaxa II.Withdoliporesepta,parenthesomecupulate A.Bsidia“cruciate-septate”

Tremellales B.Basidiaaseptate

FilobasidialesAnamorphictaxa

Sporobolomycetaceae Cryptococcaeae6精选课件传统分类方法

I.形态特征

酵母菌的细胞形态及无性繁殖方式SaccharomycescerevisiaeSaccharomycesparadoxusSaccharomycespastorianus7精选课件单极芽殖(monopolarbudding)：细胞只在一端出芽二极芽殖(bipolarbudding)：出芽只局限于母细胞相对的两端多边芽殖(multilateralbudding)：出芽发生于细胞上的多个位点裂殖(fission)：细胞以横裂的方式进行增殖A.无性繁殖方式abcd8精选课件酵母菌细胞扫描电镜照片，示芽殖细胞(B)和芽痕(箭头)9精选课件无性繁殖方式节孢子Arthrospores掷孢子Ballistospores10精选课件B.酵母菌的有性繁殖子囊菌酵母

a.非结合子囊：双倍体的营养细胞直接转化为子囊，如Saccharomyces中的种b.结合子囊：两个单倍体营养细胞结合发生质配和核配，产生双倍体子囊细胞bbbaB.子囊孢子11精选课件担子菌酵母的有性繁殖双核菌丝的形成担子菌酵母的有性阶段萌发的冬孢子(teliospore)产生担孢子的担子12精选课件C. 营养细胞的形态特征酵母菌的营养细胞可呈球形、亚球形、椭圆形、卵形、圆柱形、腊肠形、瓶状、杆状、柠檬形、S曲线形、半月形或三角形等各种形状。营养细胞的形状可反映无性繁殖方式，有时也是属或种的特征，如瓶状细胞是采取单端芽殖的Malassezia属的特征，柠檬形细胞的繁殖方式往往是两端芽殖，三角形细胞是三角酵母属(Trigonopsis)的特征，而Metschnikowialunata和Candidapeltata两个种的营养细胞多呈半月形。13精选课件D. 菌落形态特征液体培养基中的形态底部有无沉淀及其质地，表面有无膜醭或岛状醭及其质地，有无菌环固体培养基上的形态a.菌落质地：是否为奶酪状，粘液状，松脆状或坚韧状。b.菌落颜色：常为乳白色或奶油色，但注意是否有黄色，橙色，综色或红色等色调。c.菌落表面特征：是否返光或暗淡，是否平滑或粗糙，有无纹状，皱拆或疣状突起。d.菌落边缘：是否平滑(全缘)，波浪状、蚀刻状，根状或流苏状。14精选课件E. 菌丝形成有些酵母菌在进行芽殖时，芽细孢在与母细胞脱离之前连续芽殖，形成丝状体，这种由细胞连续芽殖而形成的菌丝称为假菌丝(pseudohyphae)。有些酵母菌还可形成具分隔的真菌丝，真菌丝是由顶端细胞不断生长并产生分隔形成的。在形态上假菌丝与真菌丝的区别主要为：真菌丝的分隔较直，在分隔处没有缢缩或缢缩不明显，顶细胞往往长于后面的细胞，而假菌丝的分隔只是两个细胞的交接点，弯曲且有明显的缢缩，顶端细胞一般不会长于后面的细胞。15精选课件II.生理生化特征1.糖类化合物的发酵

葡萄糖(glucose) 半乳糖(galactose) 蔗糖(sucrose) 麦芽糖(maltose) 乳糖(lactose) 棉子糖(raffinose)2.碳源化合物的同化

六碳糖：半乳糖，L-山梨糖(sorbose)；

五碳糖：D-木糖(xylose)，L-阿拉伯糖(arabinose)，D-阿拉伯糖，D-核糖(ribose)，L-鼠李糖(rhamnose) 双糖：蔗糖，麦芽糖，纤维二糖(cellobiose)，海藻糖(trehalose)，乳糖，密二糖(melibiose)；

三糖：棉子糖，松三糖(melezitose)；

多糖：可溶性淀粉；

醇类：赤藓糖醇(erythritol)，核糖醇(ribitol)，D-甘露醇(mannitol)，肌醇(inositol)，甘油(glycerol)， 半乳糖醇(galactitol)，D-山梨醇(sorbitolorglucitol)；

有机酸：琥珀酸(succinicacid)，柠檬酸(citricacid)，DL-乳酸(lacticacid)；

糖苷：杨梅苷(salicin)。

16精选课件3.氮源化合物的同化

硝酸盐(nitrate) 亚硝酸盐(nitrite) 盐酸乙胺(ethylamine.HCl)， 二盐酸尸胺(cadaverine.2HCl) L-赖氨酸(L-Lysine) 肌酸(creatine) 肌酸酐(creatinine)

4.在无维生素培养基中的生长情况测试5.温度试验

能否在37ºC下生长是酵母菌分类中一个很重要的特征 35ºC、40ºC下的生长能力也经常用到 最高生长温度17精选课件III.化学分类特征辅酶Q(CoQ，泛醌)分子类型 Q-6~Q-10，属内一致性18精选课件化学分类特征细胞壁(或全细胞)水解液单糖组成木糖Xylose19精选课件IV.超微结构—细胞壁和芽殖方式Ascomycete-typeBasidiomycete-type20精选课件超微结构—隔膜(A)Ascomycetetype(B)Basidiomycetetype(C)Basidiomycetetype21精选课件V.分子分类和分子系统学DNA碱基组成(DNABaseComposition)

属内差异多在10%以内种内差异1.0-1.5%(浮力密度法)或2.0-2.5%(热变性法)

DNA-DNA同源性

(DNA-DNAHomology)一对菌株的变性总DNA之间杂交复性的程度和稳定性，通常以相对结合百分率表示

种内：>70%

变种间：40-60%

种间：<40%脉冲电泳核型分析22精选课件核型(Karyotype)：真核细胞的染色体组成，包括 染色体数目、大小、形态结构等人类细胞染色体真菌细胞染色体23精选课件脉冲电泳(Pulsed-FieldGelElectrophoresis,PFGE)的原理及优势原理：电场不断改变,迫使DNA分子的泳动方向做相应的改变。小的DNA分子比大的变形快，故前者比后者泳动速度快，从而将不同大小的DNA分子分开。优势：分辨率可达10,000Kb(10Mb)以上E1E224精选课件YeastcellsProtoplastsAgaroseplug+++

+-

-

-

-+

+

+

++

+

+

++

+

+++

+

++ChromosomesKb #2,200 XII1,600 IV1,125 XV,VII1,020 XVI945 XIII825 II785 XIV750 X680 XI610 V565 VIII450 IX365 III285 VI225 ISaccharomycescerevisiaeCHEFelectrophoresis Ethidiumbromidestainedgel25精选课件YNN295CBS2030TCBS7099TJCM9569TCBS5256TJCM9396TAS2.1678TCBS2022TAS2.1681CBS5265TKb220016001125680450

225ElectrokaryotypesoftheSixGroupsintheC.guilliermondiiComplexGroup:IIIIIIIVVVIBaietal.2000.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.50:417-422.26精选课件DNA(或RNA)特定区段的碱基序列测定和比较18S5.8SITS226SITS1D1/D2分子系统学：DNASequencing27精选课件用于分子系统学研究的基因或DNA区段选择应符合下列要求：适当的演化速率；单拷贝或至少以单拷贝的方式演化；在所有分类群中具有相同的功能；了解或可检测其碱基组成和密码子偏好。28精选课件真菌分子系统学研究常用基因和DNA区段细胞核rRNA基因(rDNA)及其间非编码区SmallSubunit(SSU)rDNA(18S)LargeSubunit(LSU)rDNA(26S,28S)InternalTranscribedSpacer(ITS)IntergenicSpacer(IGS)蛋白编码基因

-tublingene

elongation

factor-1α(EF-1α)RNApolymeraseII等等线粒体mitochondrial(mt)DNAmtSSUandLSUrRNAgenesmitochondrialcytochrome

b(cytb)cytochrome

oxidaseIand

II(COXI,COXII)等等SSU5.8SITS2LSUITS1D1/D2

IGS2IGS15S29精选课件GenBank/EMBL/DDBJ核酸序列数据库中收录的真菌分子系统学研究常用基因序列条数(截至2005年底)NucleicrRNAGenesMitochondrialGenesProteinGenes30精选课件DNA序列数据处理及系统树构建序列片段联接和正反链校正常用软件 Lasergene(DNAStar)(/)DNASIS

(/uk/dnasis.html)Sequencher(/)BioEdit(免费软件,http:///BioEdit/bioedit.html)

从国际核酸序列数据库(GenBank/DDBJ/EMBL)中搜索(BLAST)和下裁同源序列多序列对位排列(align)常用软件ClustalW或ClustalX(免费软件)

(http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html)系统树构建31精选课件自动DNA序列测序仪测出的DNA序列图谱32精选课件匹配排列(align)之前的一组18SrDNA序列33精选课件匹配排列(align)之后的同一组18SrDNA序列34精选课件系统树构建、检验和显示分析方法Distancemethods(距离法)UPGMA(unweightedpairgroupmethodwitharithmeticmeans)Fitch-MargoliashNeighbor-joiningDiscretecharactermethods(独立元素法)ParsimonyMaximumlikelihood常用软件Phylip

(免费软件包http:///phylip.html)PAUP*(/PAUP)ClustalX(内含Neighbor-joining分析程序)检验方法Bootstrapping系统树显示(常用软件)N-JPlot(免费软件

http://pbil.univ-lyon1.fr/software/njplot.html)TreeView

(免费软件

http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)35精选课件系统发育关系分析与分类群界定Monophyleticgroups(单源类群)：来源于同一个祖先。Paraphyleticgroups(近源类群)：只包含部分来源于同 一个祖先的后代。Polyphyleticgroups(异源类群)：来源于一个以上的祖先。36精选课件子囊菌酵母的系统学地位及与其他子囊菌的亲缘关系*FromBerbee&Taylor,199937精选课件基于rRNA基因序列分析的酵母菌物种鉴别rDNAsequencing500-600bp500-600bpD1/D2或ITS序列种内碱基差异:

<1%(5-6bases)SSU5.8SITS2LSUITS1(D1/D2)38精选课件几乎所有已知酵母菌种模式菌株的26SrDNAD1/D2区和大多数种模式菌株的ITS序列已经被测定和公布，使酵母菌的分类鉴定更加快捷和准确。39精选课件StrainCY-0126SrDNAD1/D2DomainSequence(partial)40精选课件BLAST：Identities=100%41精选课件BLAST:Identities=93%42精选课件念珠菌的分类CandidaBerkhout细胞球形,椭园型,卵形,柱形或长形,罕见尖顶形,三角形,梭形或瓶形；假菌丝和分隔菌丝可产生，节孢子和掷孢子不产生。无性繁殖方式为全壁芽殖型的多边芽殖。细胞壁在透射电镜(TEM)下为双层结构。类淀粉化合物不存在。DBB反应阴性。细胞壁水解液中不存在木糖,鼠李糖和岩藻糖。163种inTheYeasts,aTaxonomicStudy,4thedn.,199843精选课件常见临床念珠菌的鉴定常见致病念珠菌种类C.albicansC.dubliniensisC.glabrataC.guilliermondiiC.kruseiC.lusitaniaeC.parapsilosisC.pseudotropicalisC.rugosaC.stellatoideaC.tropicalis感染类型鹅口疮(thrush)关节炎(arthritis)骨髓炎(osteomyelitis)心内膜炎(endocarditis)内眼炎(endophthalmitis)脑膜炎(meningitis)真菌血症(candidemia)44精选课件念珠菌感染的变化趋势念珠菌血液感染(Candidemia)致病菌1960s–1970s, C.albicans, 85-90%1988–1992, C.albicans, 42% C.tropicalis, 18% C.parapsilosis, 17% C.glabrata, 11%

C.krusei, 4%DatafromAbi-Said,D.etal.,199745精选课件API20CAUXC.albicans的鉴定厚垣孢子芽管46精选课件Candidaalbicans；Candidatropicalis；Candidakrusei灵敏度和特异性 >90-95%其他种灵敏度和特异性低Odds,F.C.&Bernaerts,R,1994CHROMagarCandida显色培养47精选课件Grownfor48honCHROMagarCandidaat37ºC.(A)C.glabrata.(B)C.parapsilosis.(C)C.albicans.(D)Geotrichumsp.Odds,F.C.&Bernaerts,R,199448精选课件Grownfor48honCHROMagarCandidaat37ºC.(E)C.tropicalis.(F)Trichosporonsp.(G)C.krusei.(H)C.norvegensis.Odds,F.C.&Bernaerts,R,199449精选课件临床念珠菌种在CHROMagarCandida培养基上的菌落特征种名菌落特征颜色形态C.albicans绿色中等大小,光滑,凸起,奶油状C.dubliniensis绿色中等大小,光滑,凸起,奶油状C.famata粉红至淡紫色中等大小,光滑,凸起,奶油状C.glabrata深蓝紫色中小菌落,光滑,凸起,奶油状C.guilliermondii粉红至淡紫色中等大小,光滑,凸起,奶油状C.inconspicua粉红至淡紫色,边沿淡菌落扁平,粗糙C.kefyr粉红至淡紫色,常中心深菌落大,粗糙C.krusei粉红,边沿淡中大菌落,扁平,粗糙C.lusitaniae粉红至淡紫色似蜡状C.norvegensis象牙色至粉红色菌落大,粗糙C.parapsilosis象牙色、粉红色至淡紫色中小菌落,光滑至皱褶C.rugosa淡蓝绿色,边沿淡中至大菌落,扁平C.tropicalis铁青色(中度灰蓝色),具紫色晕环中等大小,光滑,凸起,奶油状50精选课件都柏林念珠菌Candidadubliniensis的建立Sullivan等1995年建立和描述原始研究菌株：非典型白念珠菌，主要分离自HIV携带者和AIDS病人口腔，厚垣孢子和芽管形成阳性。属于C.albicansserotypeA，碳水化合物同化类型不典型。DNAFingerprinting表明具有独特基因型，并得到RAPD和核型分析的支持。rDNA序列分析最终确定这些非典型白念代表一个与白念近缘的独立种。Sullivan,D.Jetal.1995.Candidadubliniensis

sp.nov.:phenotypicandmolecularcharacterisationofanovelspeciesassociatedwithoralcandidosisinHIVinfectedindividuals.Microbiology141:1507–1521.51精选课件C.dubliniensis和C.albicans

的致病性差异流行病学研究表明C.dubliniensisHIV携带者和AIDS病人中为世界性分布。与C.albicans不同，C.dubliniensis

很少发现于健康人群的口腔中。很少引起念珠菌念珠菌血症

(candidemia):C.dubliniensis,2%C.albicans,65%52精选课件Candidadubliniensis的鉴别CHROMagarCandidaC.albicans:

lightblue-green(淡蓝绿色).C.dubliniensis:

darkgreen(深绿色)(只可用于鉴别从临床标本新分离的

C.dubliniensis菌株)Growth45ºCC.albicans:positiveC.dubliniensis:negativeStaibagar:C.dubliniensis:形成粗糙菌落和大量厚垣孢子C.albicans:形成光滑菌落，不产生厚垣孢子StaibP&MorschhauserJ.Mycoses42:521-524,1999.53精选课件近平滑念珠菌Candidaparapsilosis分类最新进展应用下列方法，C.parapsilosis

菌株可被分为三个明显不同的组：GroupsI,IIandIII.

RAPDMultilocusenzymeelectrophoresisITSsequencesDNArelatednessMorphotypingMitochondrialDNAsequencedifferencesDNAtopoisomeraseIIgenesequencesOligonucleotideprobefingerprintingMultilocussequencetyping(MLST)rRNAD1/D2domain重新分类：将三个组分为三个不同的种GroupI,Candidaparapsilosis

(近平滑念珠菌)GroupII,Candidaorthopsilosis

(拟平滑念珠菌)GroupIII,Candidametapsilosis

(似平滑念珠菌)TavantiAetal.JClinMicrobiol43:284-292,2005.54精选课件Unrootedradialtreeshowingnearest-neighborclusteringofsequencepolymorphismdataforCOX3,SADH,andSYA1genes.55精选课件Phylogeneticneighbor-joiningtreegeneratedfromageneticsimilaritymatrixbasedoncomparisonofITS1sequences.56精选课件白念珠菌的基因型(分子分型或分子指纹)分析MultilocusEnzymeElectrophoresis(MLEE)RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)withoutHybridizationProbesRFLPwithHybridizationProbesRandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)andRelatedPCR-BasedFingerprintingElectrophoretic

KaryotypingSequencingasaBasisforDNAFingerprinting57精选课件Examplesofstarchgelelectrophoresispatternsoftwoenzymes,mannose-6-phosphateisomerase(MPI)(A)andhexokinase(HK)(B),usedinanMLEEanalysisofC.albicansisolates.PujolCetal.1997.JClinMicrobiol35:2348-2358.58精选课件ExamplesofRAPDpatternswiththeprimersOPE-3(A)andOPE-18(B)fordifferentC.albicansisolates.PujolCetal.1997.JClinMicrobiol35:2348-2358.59精选课件ExamplesofSouthernblothybridizationpatternsgeneratedwiththecomplexprobesCa3ofC.albicans(A),Ct14ofC.tropicalis(B),Cg6ofC.glabrata(C),andCd25-1ofC.dubliniensis(D).60精选课件Image-processingandanalysiscapabilitiesofacomputer-assistedDNAfingerprintanalysisProgram(Soll,2000)61精选课件Image-processingandanalysiscapabilitiesofacomputer-assistedDNAfingerprintanalysisProgram(Soll,2000)62精选课件ModelsoftheclustersidentifiedindendrogramsofcollectionsofisolatesfromNorthAmerica