蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件

蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析张绍进蛋白质免疫印迹技术及1steanallafaWesternBlot简介aWesternBlot一般流程aWesternBlot常见问题分析steanallaf2steanallafWesternblot简介:口印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法¤1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。¤而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Easterr印迹法steanallaf3steanallafWesternblot基本原理pirateProductsss8EarTeryCSecondaryantibodBLockingagentenzymeProteinaretesteanallaf4steanallafWesternblot优点口高分辨率的电泳技术口特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白steanallaf5steanallafWesternBlot应用口目的蛋白的表达特性分析口目的蛋白与其乞蛋白的互作口目的蛋白的组织定位口目的蛋白的表达量分析steanallaf6steanallafProteinblotonWesternBlot流程蛋白样品的制备SDS转膜封闭DetectAntibody一抗杂交二抗杂交底物显色ofIntereststeanallaf7steanallaf蛋白样品的提取通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白steanallaf8steanallaf蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量:Bradford法(考马斯亮蓝法)、Lowry法(Folin-酚试剂法)、BCA法等。但各有优缺点,大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总:bbs.bbioo/thread-23639-1-1.htmlsteanallaf9steanallaf蛋白样品的变性口2×SDS上样缓冲液①100mMTris-HCI(pH6.8)1MTris-HCl(pH6.8)10ml②200mMDTT1MDTT20ml③4%SDSSDS4g④0.2%溴酚兰⑤20%甘油甘油溴酚蓝02g⑥ddH2O总体积100m口DTT可临用前以1:4比例混合加入,亦可全部配好分装,-20℃冻存口按1:1比例与蛋白质样品混合,95~100℃加热5~15min,冰上冷却后再上样,上样量一般为20-25p,总蛋白量20~50μgosteanallaf10蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件11蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件12蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件13蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件14蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件15蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件16蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件17蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件18蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件19蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件20蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件21蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件22蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件23蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件24蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件25蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件26蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件27蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件28蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件29蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件30蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件31蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件32蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件33蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件34蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件35蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件36蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析课件37蛋