利用微藻培养生产多不饱和脂肪酸的研究进展

利用微藻培养生产多不饱和脂肪酸的研究进展

目前，主要的微藻育种方法（pufs）主要用于生产十二烷基脂肪酸（pufs）。近二十年的研究表明,PUFAs具有广泛的生物学活性,在生理、营养和药理等方面有重要作用。随着对多不饱和脂肪酸的生理、营养和药理作用的阐明,对EPA、DHA等多不饱和脂肪酸的需求量越来越大,单从鱼油中提取已不能满足需要。PUFAs在动植物中都广泛存在,主要来源于海洋鱼类、细菌、真菌和藻类,当前主要用鱼油工业生产EPA和DHA等PUFAs。但用鱼油生产的PUFAs存在一些缺点,如鱼油中PUFAs含量受季节、地区、种类等的影响,鱼类资源越来越少,生产的PUFAs纯度不够且易氧化,具有特殊的鱼腥味,进一步提纯精制工艺复杂,产品成本高等,因此人们转向从其他途径获取PUFAs,两个主要方向是微生物发酵和微藻培养。张羽航等就有关利用微生物发酵生产的PUFAs的情况进行了综述,利用微藻培养生产PUFAs的研究也很多,有些已达到了工业化的规模,现将这方面的一些资料作一介绍。1浮游动物的脂肪酸组成实际上当前用于工业化生产的PUFAs的海洋鱼类并不合成PUFAs,它们是从海洋食物链中获取的,而海洋微藻才是PUFAs真正的合成者,PUFAs在海洋食物链中的过程是藻类合成→浮游动物→鱼类。同一区域的鱼类和微藻等浮游植物的脂肪酸组成有相似性。微藻合成PUFAs的过程与其他微生物基本一致,具体见附图。2pufas在鱼油加工中的应用微藻是海洋食物链中PUFAs的最初生产者,利用藻类生产PUFAs具有以下优点:首先藻细胞PUFAs含量较高,某些藻体内PUFAs的相对含量高达5%～6%细胞干重,鱼依靠食物链积累PUFAs,但相对含量远低于藻细胞;其次,从藻细胞提取的PUFAs没有鱼腥味,可用作食品添加剂,而且不含胆固醇,避免了食用鱼油时摄入大量胆固醇的缺点,可作为药用;某些藻类所含的PUFAs种类比较单纯,相对容易进行单一成分的分离提纯;藻类的繁殖周期比鱼类要短得多且受环境的影响较小;藻类可以用各种反应器进行培养,可以对营养成分和环境因素作出精确的控制,还可实现纯种培养;有些生产PUFAs的藻株可以异养快速生产,因此,可以利用现有的发酵工业设备和技术进行大规模生产;可以进一步对藻类进行基因改造,使之高效合成单一PUFAs成分等。3关于微藻生产的研究自发现微藻可合成PUFAs以来,人们从藻种筛选、培养条件优化、反应器设计和培养方式等方面都进行了广泛的研究,取得了令人瞩目的成就。3.1光自养生产设备epa各种微藻的PUFAs含量和合成能力有很大差异,因此,人们一开始就致力于寻找具有高含量PUFAs的藻株。用来筛选的藻类几乎涉及到已经发现的所有可以人工培养的微藻,如红藻(Rhodophyceae),褐藻(Phaeophyceae),绿藻(Chlorophyceae),隐藻(Crytophyceae),黄藻(Xanthophyceae),金藻(Chrysophyceae),硅藻(Bacillariophyceae),双鞭甲藻(Dinophyceae),Prasinophyceae,Eustigmatophyceae等,通过研究发现,在许多海洋微藻和巨藻中都有高水平的EPA和DHA,相反,只有几种淡水藻含有相当量的EPA和DHA。Yongmanitchai等从培养中心得到藻株或从泰国淡水水库中分离藻株,筛选其生产EPA的潜力。从20株中筛选出ChlorellaminutissimaUTEX2341和PhaeodactylumtricornutumUTEX640的EPA含量最高,各占总脂肪酸的31.8%和30.5%。P.tricornutum的生物量高达2484.5mg/L,总EPA产量比其他任何藻株都高。在EPA生产最好的藻株中DHA和AA都很低或可忽略不计。从泰国分离的藻株都不产EPA或DHA。Vazhappilly等研究了20株微藻在三角瓶中光自养生产EPA和DHA的潜能。EPA含量最高(占总脂肪酸%)的是Monodussubtcrrancus(34.2%),然后是Chlorcllaminutissima(31.3%)和Phaeodactylumtricornutum(21.4%),DHA含量最高的是隐甲藻Crypthecodiniumcohnii(19.9%),然后是Amphidiniumcarterax(17.0%)和Thraustochytriumaureum(16.1%)。EPA产量最高的是M.subterraneus(96.3mg/L),P.tricornutum(43.4mg/L),C.minutissima(36.7mg/L),P.cruentum(17.9mg/L).DHA产量最高的是C.cohnii(19.5mg/L),A.carterax(8.6mg/L)。Yongmamitchai等曾对各类微藻的脂质组成进行了总结。绿藻可积累高水平的脂质成分,但通常PUFAs仅限于亚麻酸的各种异构体。金藻类含大量的饱和和不饱和脂肪酸,有五个种含相当量的EPA(总脂肪酸的17%～28%),它们是Monochrysisluteri,Pseudopedinellasp,Coccolithushuxleyi,Cricosphaeracarterae和C.elongata,少量亚麻酸和花生四烯酸,但十八碳四烯酸和DHA含量极少。而等鞭金藻Isochrysissp.的脂肪酸组成则相反,十八碳四烯酸和DHA相对较高。黄藻和Eustigmatophyceae的脂肪酸也有少量报道,它们的脂肪酸组成基本相似且较简单。Monodussubterraneus属于黄藻,Nannochlorissp.和N.salio属于Eustigmatophyceae,它们都含大量的EPA(15%～19%),但不含DHA。硅藻在淡水和海洋中都大量存在,在海洋食物链中作为初级生产者起重要作用,因此对脂肪酸的大多数研究都集中海洋硅藻。硅藻含少量亚麻酸和十八碳三烯酸和十八碳四烯酸,十八碳脂肪酸含量少是硅藻的特点,主要的PUFAs是EPA,几乎没有DHA。双鞭甲藻的PUFAs由三种脂肪酸组成,十八碳四烯酸、EPA和DHA,这类藻的特点是DHA含量特别高,有三个种,Crypthecodiniumcohnii,Gonyaulaxcatenella和Gymnodiniumnelsoni含30%的DHA或更多。此外,Amphidiniumcarteri和Gonyaulaxdigitale含EPA和DHA也较高。红藻主要是巨藻,含较高的AA和EPA,没有DHA。由于是巨藻,几乎不可能在控制条件下培养,多从天然资源中收获提取。但红藻中的紫球藻Porphyridiumcruentum是一种含大量AA和EPA的微藻,可以在实验室无菌条件下生长。褐藻的大小、脂肪酸组成与红藻相似。绿藻具有生长速度快的优势,大多数是微藻,单细胞或丝状,常含较少的PUFAs。但有一种海洋单细胞绿藻Chlorellaminutissima含EPA较高,在最适条件下占总脂肪酸的45%,可以用于工业生产EPA。Prasionophyccac含相当量PUFAs的是Heteromastrixrotundra,隐藻含脂肪酸种类多,主要的PUFAs是亚麻酸、十八碳四烯酸和EPA。除了高PUFAs含量外,微藻的生长速度是决定其能否用于工业化生产PUFAs的另一重要因素。实验表明,绿藻的生长速度较快,在许多国家都曾进行过绿藻的中试生产。根据筛选结果,普遍认为用于生产DHA的最好藻种是异养海藻隐甲藻Crypthecodiniumcohnii,该藻株具有高生物量、高生长速率、高DHA含量、不含EPA和异养生长好等特点。而生产EPA的藻种则有M.subterraneus,P.tricornutum,C.minutissima等。M.subterraneus是生产EPA的最好藻株,该藻具有高生物量、高生长速率、高EPA含量和无DHA的特点。P.tricornutum的特点是EPA占总脂肪酸比例高,且能高细胞密度生长,从下游加工处理角度看,该藻含DHA极少,不存在分离DHA和EPA的潜在困难。而紫球藻Porphyridiumcruentum随培养条件不同其脂质组成变化较大,主要含AA和EPA,通过培养条件的控制,既可用于AA的生产,又可用于EPA的生产。3.2角褐指藻的生长和产epa大量研究表明,微藻中脂肪酸组成与环境条件和培养基组成密切相关,同一藻种在不同条件下各种PUFAs的含量有很大差异,如紫球藻中所含的PUFAs是花生四烯酸(AA)和EPA,但在不同条件下AA和EPA相对含量变化很大。在最适生长条件下,生长速率快,EPA高,AA含量低;相反,在光限制、非最适温度或pH、增加盐度、营养饥饿(C或N)和加入抑制剂等非最适条件下,生长速度慢,EPA含量大大下降,AA含量急剧上升。因此人为控制紫球藻的生长条件可以定向生产某一种PUFAs。所以利用微藻培养生产脂肪酸,必须对培养条件进行优化。Yongmanitchai等研究了氮源、磷源、氯化钠、生长因子、前体物质、温度、起始pH和接种量对三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)生物量和产EPA的影响。随硝酸盐和尿素浓度的增加,EPA占总脂肪酸的比例增加,氯化钠无明显影响,VB1和VB12对生长无明显影响,VB12增加EPA产量65%,通入含1%CO2的空气时EPA产量最高;EPA生产的最适温度和起始pH分别为21.5℃～23℃和7.6。EPA产量133mg/L,占总脂肪酸的30%～40%。Iwamoto用M.subterraneus的研究发现低温、低光强有利于M.subterraneusEPA合成,在异养和混养条件下受氯化钠浓度的显著影响。Cohen的研究表明氮饥饿可增加其脂肪酸含量,但减少EPA含量和比例,低光强或高生物量浓度增加EPA比例。Seto用海洋小球藻C.minutissima的研究表明,25℃时脂质含量比20℃时高60%,EPA比例20℃时为45%,25℃时为20%,添加氯化钠可增加脂质含量。普遍认为,PUFAs积累是不适生长条件适应的结果。从最适温度30℃到亚最适温度18℃,诱导盐藻β-胡萝卜素合成和增加脂质含量,PUFAs也较高。隐甲藻异养生长只合成一种PUFAs,占总脂1%。在发酵罐培养中,通空气产DHA11%,而通氮气则无DHA,温度和盐度变化无明显影响。姜悦系统研究了利用隐甲藻Crypthecodiniumcohnii生产DHA。发现温度为25℃时最有利于细胞的生产和DHA形成,Porphyridium培养基中葡萄糖为34.6g/L、胰蛋白胨为9.14g/L、氯化钠为9.26g/L、磷酸盐为0.546g/L、起始pH6.8时有利于CrypthecodiniumcohniiATCC30556的生长和DHA形成。3.3微藻培养新型生物反应器pufas微藻的大规模工业化生产多采用机械搅拌的开放池式生产系统,这种藻培养系统存在下列不足:易受外界环境影响,难以保持较适宜的温度与光照;易受到灰尘、杂菌、杂藻、昆虫等的污染;水分极易蒸发;藻液浓度低,收获成本高等。能在这类池中培养的藻类均应具备极端的生长条件,但大多数藻类并不具备这样的条件。因此,为了能使微藻培养生产的PUFAs成为可能,人们开发出微藻培养新型生物反应器。PUFAs研究中多采用密闭式光照反应器。这类反应器有下列优点:与易染物隔离,利于纯种培养;降低水分蒸发;温度易于控制;增加了细胞浓度,降低了收获费用等。用于微藻培养生产PUFAs的主要反应器有水平式管道生物反应器(如脉动混合管道生物反应器、其升式管道生物反应器、倾斜可调式管道生物反应器等)、垂直式管道生物反应器(如螺旋式管道光生物反应器、鼓泡柱板式光生物反应器等)、发酵罐式光生物反应器(如轴心式光生物反应器、搅拌罐式光生物反应器、气旋式光生物反应器等)、多级箱式光生物反应器、浅层溢流光生物反应器等。此外还发展了可实现培养条件计算机在线控制的光纤式光照反应器,通过培养基组成和培养条件,实现连续培养。3.4细胞浓度对分离效果的影响各种微藻反应器培养藻都离不开光照,但随着藻细胞浓度的增加,细胞之间会发生相互遮掩现象,使光利用率下降,细胞增长速度降低。因此,这种反应器培养微藻,最终的细胞浓度仍然较低,并不能有效地降低微藻的分离成本。在这种情况下,最近有研究试图用异养方式工业化生产PUFAs。Chen等利用葡萄糖和乙酸盐两种碳源研究了用于筛选生产的PUFAs的二十种藻株的异养生长情况。除Nannochloropsisoculata外,在葡萄糖为5g/L时都生长有12种可以在1g/L乙酸盐中生长。MartexBiosciece公司已经用发酵罐异养培养隐甲藻生产DHA。3.5藻体表面活性剂的选择从微藻中提取PUFAs主要采取以下步骤:藻体收集→冷冻干燥→脂肪酸萃取→脂肪酸转酯化→分离、纯化。由于不同的藻体内PUFAs在脂肪中的分布部位不同,如在Isochrysisgalbana