超声辅助提取蒙古栎种壳多酚的研究

超声辅助提取蒙古栎种壳多酚的研究

蒙古橡树是地壳动物科的一种多年生树木，主要分布在中国东北、华北和西北地区，也分布在中国中部和南部。同时,蒙古栎是我国的主要阔叶树种之一,储量丰富。但是,蒙古栎资源利用率却不高,往往仅对树干的木质部分进行加工利用,而对种壳、种仁、橡托等剩余物资源却少有利用,仅作为初级燃料烧掉或弃之不用。对蒙古栎种壳的研究主要集中在食品色素等方面,张国友等发现蒙古栎叶片内含有丰富的酚类物质,并对其抗氧化能力和多酚含量做了研究,Kanji等从蒙古栎中分离了D-threo-guaiacylglycerol8-O-,L-threo-guaiacylglycerol8-O-,3-methoxy-4-hydroxyphenol1-O-,gentisicacid5-O-,3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenol1-O-andcis-coniferylalcohol4-O-β-(6′-O-galloyl)glucopyranosides等酚苷。另一方面,传统人工合成的抗氧化剂,如BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(二丁基羟基甲苯)等由于对人体具有毒副作用,联合国粮农和世界卫生组织食品添加剂委员会已对此类化合物的使用做出严格规定,回归自然的呼声日益高涨,从天然资源中寻找天然抗氧化物质已成为一种趋势。笔者前期研究中发现,蒙古栎不仅叶片中含有多酚类抗氧化物质,种壳里亦含有丰富的多酚化合物。超声辅助提取是近年来发展起来的新型、高效,并避免高温对提取成分影响的提取技术。同时,由于响应面法在工业研究中业已得到广泛应用,本文利用超声辅助提取法对蒙古栎种壳多酚进行了提取,对超声提取过程中的各因素在单因素实验的基础上应用Box-Behnken中心组合进行3因素3水平的实验设计法进行了多酚得率与纯度双响应值的优化,并对产品清除自由基的活性进行了研究,以期为蒙古栎种壳多酚提取方法的完善提供理论参考,有利于蒙古栎种壳多酚的进一步开发与应用。1自然阴干材料实验材料蒙古栎种子于2007年9月采摘自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学校内(N45°43.096′,E126°38.036′),并经东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室聂绍荃教授鉴定。自然阴干后手工剥壳,种壳使用前粉碎并筛分,取粒径250~850μm作为实验材料。Folin-Ciocalteu试剂、和1,1-二苯代苦味酰基自由基(DPPH)、二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基-4羟基茴香醚(BHA)、L-抗坏血酸(VC)和维生素E(VE)购自美国Sigma公司;没食子酸对照品购自中国药品与生物制品检定所;其它试剂均为国产分析纯。2测试方法2.1分析2.1.1对照品溶液的制备采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量,结果以每克提取物中含有相当没食子酸的毫克数来表示。以没食子酸为对照品,分别精密称取没食子酸3、6、12、15、18、21、24和28mg,并置于100mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,作为没食子酸对照品储备液。然后,取1mL对照品储备液与1mLFolin-Ciocalteu试剂混合,静置4min后加入1.0mL的10%Na2CO3溶液,最后用去离子水定容至25mL,室温反应2h,765nm测定吸光度。每样重复进样3次,将峰面积取平均值。以吸光度为横坐标,没食子酸浓度(mg·mL-1)为纵坐标,绘制标准曲线:y=0.27x-0.021(相关系数R=0.9964,线性范围:0.148~1.565mg·mL-1)。2.1.2含量测定取浓度为5mg·mL-1的各提取物样品甲醇溶液1.0mL与1.0mLFolin-Ciocalteu试剂混合,静置4min后加入1.0mL的10%Na2CO3溶液,最后用去离子水定容至25mL,室温反应2h,765nm测定吸光度。每样重复进样3次,将峰面积取平均值,代入标准曲线方程,按式(1)计算各目的成分的得率,按式(2)计算浸膏得率(纯度)。Y=c×V/m(1)P=c×V/m′(2)Y=c×V/m(1)Ρ=c×V/m′(2)式中:Y:得率(%);P:纯度(%);c:目的成分的浓度(μg·mL-1);V:提取液体积(mL);m:原料质量(g);m′:浸膏质量(g)。2.2影响提取效果的因素测试2.2.1提取条件的确定准确称取2.0g蒙古栎种壳原料,置于50mL锥形瓶中,在多种条件下提取,以确定提取因素变化范围以及各因素的适宜值。将每次提取液过滤,滤液减压回收溶剂并于60℃减压干燥,计量浸膏质量,测定多酚的含量,并计算得率和浸膏纯度。2.2.2超声提取过程的响应面优化试验单因素试验结果显示提取次数对目标产物的影响已很明确,即提取次数越多,得率越高,因此提取次数因素不做进一步优化。超声提取过程的主要影响因素包括乙醇体积分数、提取时间和液料比。以上述影响因素作为考察对象,采用DesignExpert7.0统计分析软件的响应面分析法分别以多酚得率与纯度为响应值,进行响应面优化试验,以获取最适参数。试验因素和水平安排见表1。对蒙古栎种壳中多酚的得率和纯度的超声波提取条件进行综合优化,得出结论。2.3抗氧化活性的测定参照Wu等的方法并略作改动,将0.1mL不同浓度的多酚样品的95%乙醇液加入3.9mL的25mg·L-1的DPPH的95%乙醇液中,在黑暗处放置30min后,在517nm处测定吸光值,计为A样品,以相同体积的95%乙醇代替样品测定的吸光值为空白对照,清除DPPH自由基能力用SC%表示,SC%=(1-A样/A对照)×100%,其中A对照为不加样品的溶液在t=0时的吸光值,所有吸光值均测定3次,结果取平均值,拟合非线性回归曲线,得出EC50值。3结果与讨论3.1单一因素对提取效果的影响3.1.1蒙古栎种壳中多酚得率与纯度的变化提取时间对蒙古栎种壳多酚得率、纯度的影响如图1a所示。由图中可以看出,随着提取时间的增加,得率与纯度呈递增趋势,但在40min后增长趋势不明显。提取40min后,蒙古栎种壳中多酚得率与纯度的影响小。选择提取时间30~50min为进一步优化范围。3.1.2乙醇体积分数对多酚得率的影响乙醇体积分数对目标产物得率的影响如图1b。由图中可以看出,随着乙醇体积分数的增加,多酚得率在乙醇体积分数大于60%后呈现平缓趋势;多酚纯度变化范围不大,且当乙醇体积分数大于50%后,其变化趋势较为平缓。因此选择乙醇体积分数50%~70%为进一步优化范围。3.1.3料比对蒙古栎种壳多酚得率的影响液料比对目标产物得率的影响如图1c。由图可以看出,随着液料比的增加,蒙古栎种壳多酚得率呈略微增加;而随着液料比的增加,目标产物的纯度却略有降低的趋势。本着节约溶剂使用量的原则,选择液料比25~35mL·g-1为进一步考察优化范围。3.1.4提取次数的选择考察提取次数对蒙古栎种壳中多酚提取效果的影响,结果见图1d。由图可以看出,随着提取次数的增加,得率呈略微递增趋势,当提取4次时,纯度明显下降;同时考虑到增加提取次数,会增加溶剂的使用量,溶剂回收成本高,提取次数选择3次较合理。规模生产时亦可考虑提取3次,最后1次的提取液作为下一批次的提取溶剂使用,以降低成本。3.2实验模型和各试验因子的交互作用RSA试验设计组合和蒙古栎种壳中多酚超声波提取响应面试验中,17个试验点可以分为两类:一类是析因点,自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点,共有12个析因点;另一类是零点,为区域的中心点,零点试验重复5次,用以估计试验误差。RSA试验设计与试验结果见表2。以蒙古栎种壳中多酚得率与纯度为响应值,经回归拟合后,根据Box-Behnken设计中ANOVA分析,实验模型显著、可靠(significant)。具体参数如表3。在各项方差分析中,当p值小于0.05时表明影响显著;p值小于0.001时表明影响极为显著。因此,在多酚得率中,A2,B2,C2这3个二次项对多酚得率影响显著;在多酚纯度中,A这个一次项对多酚纯度影响显著,A2这个二次项对多酚纯度影响显著;B2,C2这2个二次项对多酚纯度极为显著。同时,通过对F值的比较可知:在多酚得率中,各试验因子对响应值影响次序是:C液料比>A提取时间>B乙醇体积分数;在多酚纯度中,各试验因子对响应值影响次序是:A提取时间>C液料比>B乙醇体积分数。其中,BC两因子的交互作用最为明显,如图2。应用designexpert7.0Box-Behnken设计中OptimizationChoises的NumericalOptimization对3种目标产物的得率与纯度进行最优化设计,得到蒙古栎种壳中多酚得率及纯度最佳的提取条件为:乙醇体积分数60.56%,提取时间42.39min,液料比30.72mL·g-1,提取次数3次。多酚得率及纯度分别为0.38%和18.8%。该优化设计的合意性为0.906(图3)。3.3抗氧化的ec50抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力一般用EC50值表示,即达到DPPH清除率50%时抗氧化剂的浓度。将蒙古栎种壳多酚样品配制成不同浓度的溶液,检测其对DPPH自由基的清除效果,并与合成抗氧化剂BHT、BHA、VC和VE的清除效果经Excel做图比较,结果见图4。由图中数据,经SigmaPlot软件处理后,计算出合成抗氧化剂BHT、BHA、VC、VE和蒙古栎种壳多酚样品的回归曲线分别为:BHT,y=-8611.75x2+1425.1152x+6.3018,R=0.9604;BHA,y=-13245.2477x2+2160.0086x+4.6515,R=0.9893;VC,y=-144621256x2+2291.0282x+4.8877,R=0.9891;VE,y=-8431.7396x2+1406.4228x+6.227,R=0.9607;多酚样品,y=-18188.4149x2+2577.8857x+10.2936,R=0.9536。并可知,不同抗氧化剂的EC50分别为:蒙古栎种壳多酚,176μg·mL-1;BHA,246μg·mL-1;BHT,406μg·mL-1;VC,230μg·mL-1;VE,414μg·mL-1。可知蒙古栎种壳中多酚清除自由基的能力要强于上述常用的合成抗氧化剂,并且蒙古栎种壳多酚含量与DPPH清除能力具有明显的量效关系。4蒙古种壳中多酚的提取采用超声提取法以蒙古栎种壳中多酚为指标成分,同时以各指标成分的得率和纯度为响应因子对