水稻基因转化

2.9水稻基因转化通过农杆菌介导法转化水稻主要参考前人报道的方法2.9.1水稻成熟胚培养诱导愈伤去壳的水稻种子先用70%酒精（加一到两滴Tween100）进行表面消毒3min后，5%的次氯酸钠浸泡30min,无菌水冲洗3-4次点播于NB培养基上诱导愈伤组织。20d左右从成熟胚盾片处挑选色泽淡黄且致密的愈伤组织继代，以后每两周继代一次。2.9.2农杆菌对水稻愈伤组织的侵染（1）在含有抗生素的YEB液体培养基中接菌，28°C,150rpm培养2-3d。⑵于4C,5000rpm离心3min,去上清；重悬于AAM培养基（含0.1mmol/L乙酰丁香酮，AS）中，28C避光震荡培养1-2h,至OD600=0.4左右。（3）选择生长状态良好的的颗粒状的愈伤组织浸入农杆菌培养液中，150rpm，震荡培养20min后，取出并用无菌滤纸吸十多余菌液，将愈伤组织接种于共培养基上培养。2.9.3抗性愈伤组织的筛选侵染后的水稻愈伤组织于NB共培养基上培养2-3天后，转至含150mg/LG418以及500mg/L头孢霉素的NB培养基上筛选3周（一筛），然后将愈伤组织转入二筛培养基（含200mg/LG418及200mg/L头孢霉素的NB培养基）上筛选3周，随后将抗性愈伤组织转入分化培养基（含200mg/LG418）上（16h光照/d）进行分化，再生植株在含有200mg/LG418的1/2MS培养基壮苗培养基上生根后，经2-4天炼苗后移至试验田，同时取叶片提取DNA进行转基因验证。培养基及溶液培养基：LB液体培养基：150mL蒸馏水中加入胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl2g，用5mol/LNaOH调pH值至7.0，用量筒定容至200mL。LB固体培养基：LB液体培养基200mL+琼脂粉1.5g。YEP培养基：90mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1g，酵母提取物1g，NaCl0.5g，用5mol/LNaOH调pH值至7.0，用量筒定容至100mL。基本培养基（NB）：N6大量元素+B5有机成分、微量元素和铁盐+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L，pH5.8。愈伤组织的诱导和继代培养基：NB+2,4-D2mg/L,pH5.8。高渗培养基（基因枪法）：NB+2,4-D2mg/L+甘露醇0.2mol/L+山梨醇0.2mol/L,pH5.8。筛选培养基（基因枪法）：NB+2,4-D2mg/L+草铵膦4mg/L（8mg/L），pH5.8。分化培养基：NB+NAA0.5mg/L+6-BA2mg/L+草铵膦8mg/L，pH5.8。壮苗培养基：1/2MS培养基。共培养固体培养基（农杆菌法）：基本培养基+2,4-D2mg/L+乙酰丁香酮100pmol/L，调PH至5.5。共培养液体培养基（农杆菌法）：不加琼脂粉，其余成分同共培养固体培养基（农杆菌法）。筛选培养基（农杆菌法）：基本培养基+2mg/L2,4-D+头孢霉素500mg/L+羧苄青霉500mg/L和草铵膦8mg/L。溶液：1）1mol/L亚精胺：溶解亚精胺2.55g于足量的水中，使终体积为10mL，分装全1.5mL离心管贮存于-20°C。0.5mol/LEDTA:Na2EDTA.2H2O186.1gNaOH20g,溶于水中，定容至1L。10mg/mLRNaseA：RNaseA10mg溶解于1mL的10mmol/L乙酸钠水溶液中(pH5.0)。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris-HCl调pH至7.5,于-20C贮存(配制过程中要戴手套)。5mol/L氯化钠：溶解氯化钠29.2g于足量的水中，定容至100mL。10mol/L氢氧化钠：溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中(磁力搅拌器搅拌)，氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。10%SDS(十二烷基硫酸钠)：称取SDS100g慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水定容至1L。2mol/L山梨醇：溶解山梨醇36.4g于足量水中使终体积为100mL。2.5%X-gal(5-漠-4-氯-3』引哚一。-半乳糖苷)：溶解25mg的X-gal于1mL的二甲基甲酰胺(DMF),用铝箔包裹装液管，贮存于-20C。20XSSC：溶解柠檬酸三钠(二水)88.2g和氯化钠175.3g于约0.9L水中，加几滴10NNaOH溶液调pH至7.0，用水补足体积至1L。DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水：加100plDEPC于100mL水中。在37C温浴至少12h，然后在15psi(103.425KPa)条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。5XTris-硼酸缓冲液(TBE)：Tris碱54g，硼酸27.5g，溶于适量双蒸水中，加入0.5mol/LEDTA20mL(pH8.0)，双蒸水补足1L。1%漠酚蓝：加1g水溶性钠型漠酚蓝于100mL水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。10mg/mL的漠化乙锭：小心称取1g漠化乙锭，转移到烧杯中，加100mL水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4C贮存。氨苄青霉素(100mg/mL)：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10mL，过滤灭菌，分装后，-20C贮存。卡那霉素(50mg/mL)：溶解500mg卡那霉素于足量的水中，定容至10mL，过滤灭菌，分装后，-20C贮存。变性液：1.5mol/LNaCl,0.5mol/LNaOH。中和液：1mol/LTris-HCl(pH8.0),1.5mol/LNaCl。转移液(20XSSC)：3mol/LNaCl,0.3mol/L柠檬酸钠(pH8.0)。Tris缓冲液：将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH(25C下)加一定量的浓盐酸(11.6mol/L)，用水调整终体积至1L。TE缓冲液：1mol/LTris-HCl1mL(pH7.4-8.0，25C)，0.5mol/LEDTA(pH8.0)200p匚，双蒸水98.8mL。GUS缓冲液：50mmol/L磷酸钠缓冲液(PH7.0)、10mmol/LEDTA、0.1%(V/V)TritonX-100,4C下保存备用。GUS溶液：用N，N-二甲基甲酰胺溶解X-Gluc粉剂，配成50mg/L的溶液，于-20C下备用。GUS染色液：GUS缓冲液900pL与GUS溶液100pL即得到GUS染色液1mL，现配现用。乙酰丁香酮(AS):AS981mg溶入二甲基亚飒50mL中，得到1000倍溶液，用量1mL/L。利福霉素(25mg/mL)：250mg溶入10mL无水甲醇。26） 羧苄青霉素（Cb）：1250mg溶入50mL水中（25mg/mL）,过滤灭菌后分装于无菌离心管。27） 头孢霉素（Cef）：1000mg定容10mL水（100mg/mL），过滤灭菌后分装于无菌离心管。28） 洗膜液I：2XSSC,0.5%SDS。29） 洗膜液II：2XSSC,0.1%SDS,30）洗涤缓冲液：0.1M顺丁烯二酸，0.15MNaCl（pH7.5, 20°C）, 0.3%（v/v）Tween-20。31） 阻断液（22mL）:顺丁烯二酸1mL,10X阻断液2mL,水19mL。MeduitCompositionAAMAAsaltsandaminoatids（TgriyamaandHinata,1985|,MSvitamins（MurashiqaandSkoog1962},500mg11casaminoacids1岚,5gI-1susnase.36gI-1glucose,10CpMacetnsyringor>&hpH52N6F N6majorsalts,N6minorsaterandN6vitamins（Chu1978）,sucrose20gr1,2gI-1Gelrite（MertkhpH5.8,N6F-HN6Fmediumplus70mgI-1hygromydn.N6S3Haif-strengthN6majorsafts,N6minersafe,N6vitamtnsrAAaminoackish1gr1casairrinoacid,20gr1sucrose,02mgr1n叩hthaleneaceticacldh1mg11kinetin,3gI-1Gelrite,pH5.8.N6S3-AS N6S3mediumplus1CgT1glucoseand100[Macatosyringone,pH52N6S3-CH N6S3mediumplus250mgI-5cefotaximeand50mgI-1hygromycin.N6-7-CHN6majorsalts,N6minorsalts,N62g11casaminoacid,20gP1sucrase,30g尸sorbHol,1mgF2h4-DP

0.5mgH6-benzyladenine,100mgr1hygromycin,250mgr1cefotaxime,2gFGel旭pHSAN6-7K-CHHalf・MngthN6majorsalts,N6minorsalts,Nfivilani膈2gl-1casaminoacids,200mlI-1potatoexlract1,20gI-1sucrose,30gI-1sorbitol1mgr12,4-0.OSmg116-benzylaciflnine,100mgI-1 250mgr1cofotax而e,2gI-1Gelrit土pH58,2N6 N6majors3lts1N6minorsalts,N6vitamins,1gF邮mmiroacids,30gI-1sucrose,2mg11 2gf-1Gelnte,pH5,8.2N6L2N6mediumwithoutGelrite.2N6-AS2N6mediumplus10gI-1glucoseand100呷ao^tosynngoneipH5J.2N6-CH 2N6mediumplus250mgI-1cefota