米氏常数的测定

底物浓度对酶促反应速度的影响――米氏常数的测定一•目的要求1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。1.2掌握测定米氏常数K的原理和方法。m二•实验原理酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：_V[s]v—K+[s]m式中：v 反应初速度（微摩尔浓度变化/min）；V——最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；[s] 底物浓度（mol/L）；K——米氏常数（mol/L）。m这个方程表明当已知Km及V时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特彳征常数之一。不同的酶，K值不同，同一种酶与不同底物反应K值也不同，m mK值可以近似地反应酶与底物的亲和力大小：K值越大，表明亲和力小；Km m m值小，表明亲和力大。则测K值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的mK值在0.01〜100mmol/L。mLinewaeaver-Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测K值的最常用m的简便方法： 1K11=一m・ +一vV[s]V实验时可选择不同的[S]，测定对应的v,以V对占作图，得到一个斜率为+的直线，其截距右则为K-，由此可求出Km的值（截距的负倒数）。m本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver-Burk双倒数作图法测定双倒数作图法。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。三•试剂和器材3.1试剂10〜30g/L的酪蛋白溶液（pH8.5）：分别取10、20、25、30g酪蛋白溶于约900mL水中，加20mL1mol/LNaOH连续振荡，微热直至溶解，以1mol/LHCl或1mol/LNaOH调pH至8.5，定容1L,即生成四种不同［s］的酪蛋白标准溶液。中性甲醛溶液：100mL分析甲醛加20mL0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1mol/LNaOH滴至微红，密闭于玻璃瓶中。0.25%酚酞乙醇溶液：2.5g酚酞以50%乙醇溶解，并定容至1L。标准0.1mol/LNaOH溶液：事先用邻苯二甲酸氢钾标定过。3.2材料胰酶溶液：称取3g胰酶（胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物）溶于25ml蒸馏水中，放入冰箱保存。3.3器材恒温水浴；50ml三角烧瓶（X16）,150ml三角烧瓶（X4）；吸管5ml（X1），10ml（X5）；量筒100ml（X4）；25ml碱式滴定管及滴定台，蝴蝶夹；恒温水浴；滴管。四•操作方法取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞，以0.1mol/L标准NaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。量取30g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37°C保温10min,然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！充分混合后立即取出10mL反应液（定为0号样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞。以0.1mol/LNaOH毫升数，记下耗去的0.1mol/L标准NaOH的毫升数。在2min，4min，6min时，分别取出10mL反应液，加入2号，3号，4号小三角瓶，同上操作，记下耗去NaOH的毫升数。以滴定度（即NaOH的毫升数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。然后分别量取25g/L，20g/L，10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V25、V20、V10。利用上述结果，以1/v对1/［s］作图，即求出V与Km值。

五•实验数据处理5.1.实验原始数据记录：如表1中所示。表1实验数据记录实验号（酶解时间/min）1(0)2(2)3(4)4(6)酪蛋白浓度NaOH消耗的体积/ml10g/L0.881.321.521.7420g/L1.191.672.072.3525g/L1.511.872.292.8030g/L1.511.982.532.995.2相对各浓度酪蛋白的各初速度值以滴定度（即NaOH的毫升数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度值。（1）相对于10g/L酪蛋白的初速度V102.8EA.21111b.6.42O..O..O..O..根据数据作图得图1-1。由图1-1中得直线方程y=0.139x+0.948,其斜率为0.139，即为V10=0.139g/L・min。2.8EA.21111b.6.42O..O..O..O..y=0.139x+0.948

R2=0.96151 2 3 4 5 6 7图1-1底物浓度为10g/L的滴定曲线 加祜（2）相对于20g/L酪蛋白的初速度V20根据数据作图得图2。由图2中得直线方程y=0.194x+1.238,其斜率为0.194,即为V20=0.194g/L・min。,52y二0.194X+1.238,52y二0.194X+1.238R2=0.986825116 7T/min6 7T/min图1-2底物浓度为20g/L的滴定曲线(3)相对于25g/L酪蛋白的初速度V2532.5根据数据作图得图1-3。由图1-3中得直线方程y=0.215x+1.474，其斜率为0.215,即为V25=0.215g/L・min。32.5¥二0.215X+1.474

R2=0.993901234567(4)相对于30g/L酪蛋白的初速度V3浓度为25g/L的滴定曲线 T/m'nroro3.y=0.250x+1.504R3=0.99881 2 3 4 5 6 7图1-4底物浓度为30g/L的滴定曲线 Vmin

根据数据作图得图1-4。由图1-4中得直线方程y=0.250+1.504，其斜率为0.250,即为V30=0.250g/L・min。5.3求解V与Km值表2求得的v与［s］值酪蛋白浓度［s］/(g/L)1/[s]初速度v/(g/L・min)1/v100.1000.1397.194200.0500.1945.155250.0400.2154.651300.0330.2504.000以1/v对1/［s］作图，得一直线(见图2),其斜率即Km/V,截距即1/V,即求出V与Km值。以，Km=45.14/2.7334=16.51g/Lk1/5对1/V作图六•实验结果与讨论实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制并加速逆反应的进行，酶在一定PH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。在本实验中，图1-1和1-2线性不是很理想，可能的原因有：酶促反应的时间没有得到严格的控制实验所用的酶是粗酶液，是胰酶溶液是胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物，并不是纯酶。我们知道酶的催化具有高度的专一性，一种酶只能作用于特定的底物，所以本实验中所用的酶不能准确反应酶作用于底物的反应速度。七•思考题1•试述底物浓度对酶促反应速度的影响。在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，反应相对于底物是一级反应。在较高的底物浓度下，酶被饱和，进一步提高底物浓度，反应速度提高，但并不是成比例增加，反应相对于底物是混合级反应。当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不增加，反应相对于底物是个零级反应。在实际测定中，即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应速度并没有因此增加，甚至受到抑制。其原因是：高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。过量的底物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反应速度。2.在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？当酶作用的底物是酶的最适底物时，并且在最适的pH最适温度以及离子强度等条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段。因为同一种酶的不同底物作用，不同pH、温度以及离子强度等条件下测定的Km值是不同的。3•米式方程中的Km值有何实际应用？鉴定酶：通过测定Km,可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。判断酶的最适底物：一种酶如果可以作用于几个