小球藻对3种抗生素敏感性的研究

小球藻对3种抗生素敏感性的研究

微藻是一种广泛分布于陆地和海洋中的自养植物。它具有丰富的营养成分和高的光合利用。但在微藻的培养过程中经常发生菌污染现象,限制了藻的正常生长和繁殖。因此,人们在研究微藻营养价值、生理生化、毒理学、药理学等过程中,往往需要在藻液中加入适量抗生素。然而,不同的抗生素对微藻生长和繁殖的影响不同。刘卫东等用抗生素对3种海洋微藻(牟氏角毛藻、球等鞭金藻8701、盐藻)进行试验,发现不同微藻生长所需的抗生素浓度不同,抗生素对微藻生长的影响不完全取决于抑菌作用,青霉素促进球等鞭金藻8701生长主要是产生促生长因子,庆大霉素抑制生长可能是产生抑制因子。岳伟萍选用氨苄青霉素对4种海洋微藻进行实验,发现4种海洋微藻普遍对氨苄青霉素有抗性。赵培等采用青霉素、硫酸庆大霉素、头孢他啶3种常用抗生素处理海洋微藻(小球藻、球等鞭金藻、紫球藻),结果表明抗生素可抑制水生细菌的繁殖,在除菌、抑菌方面表现出了不同的作用。不同藻种对各抗生素的敏感性不同,不同抗生素对菌的抑制能力也不相同。该研究以小球藻(Chlorellasp.)为研究对象,探讨青霉素、氨苄青霉素、头孢他啶等3种抗生素对其生长和抑菌能力的影响,为藻类纯化技术研究提供相关依据。1材料和方法1.1试验藻类小球藻购自中科院水生生物研究所藻种库。1.2仪器、仪器和检测方法主要仪器:UV-1200型可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);血球板计数器(上海求精生化仪器有限公司);XS-200显微镜(上海光学仪器厂)。主要试剂:青霉素钠(80万IU)购自石家庄中诺药业有限公司;氨苄青霉素(100万IU)购自北京拜尔迪生物技术公司;头孢他啶(80万IU)购自上海先锋药业公司。1.3方法1.3.1藻细胞密度测定藻细胞在一定生长时期内的生物量与其在最大吸收波长下的吸光度值成正比,故用最大吸收波长下的吸光度代替血球板计数法测定培养液中的藻细胞密度。1.3.2微量元素溶液选择生长良好的藻种扩大培养,5d为一周期进行继代培养,活化3次,每天摇瓶3~5次,观察微藻生长情况,待进入对数生长期时,将其接种至一定的初始密度,用于抗生素敏感性试验。预培养微藻的营养盐配方(g/L):NaNO30.25、K2HPO40.075、MgSO4·7H2O0.075、CaCl2·2H2O0.025、KH2PO40.175、NaCl0.025、FeCl3·6H2O0.0005、EDTA-Fe0.00206和微量元素溶液(mg/L):H3BO32.86、MnCl2·4H2O1.86、ZnSO4·7H2O0.22、Na2MoO4·2H2O0.39、CuSO4·5H2O0.08、Co(NO3)2·4H2O0.05。温度控制在(24±1)℃,光暗比为12h∶12h,光照强度500~1500lx。在藻种传代及培养过程中,均严格遵循无菌操作。1.3.3加抗生素的筛选将青霉素,氨苄青霉素,头孢他啶分别按0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L浓度加入到100ml处于对数生长期的藻液中。以未加抗生素的藻液为对照,每组设3个平行。培养观察,每天摇瓶3~5次,每3d测藻液686nm处光吸收值OD686。1.3.4细胞密度试验用分光光度计测定686nm处藻液的吸光值,以反映细胞密度的大小。每个试验重复3次,结果取3次试验数据的平均值。生长率(%)=(某一天藻细胞密度-初始藻细胞平均密度)/初始藻细胞平均密度2结果与分析2.1激素对小球藻繁殖的影响由图1可知,在液体培养中,青霉素既能抑菌又能抑藻,10.0mg/L的青霉素对小球藻的生长有明显抑制作用,但不能完全抑制,即培养1周后藻液出现絮状,说明10.0mg/L的青霉素超过了藻细胞的耐受能力,藻细胞的生长繁殖受到了明显的抑制。与对照相比,其他浓度的青霉素对小球藻生长均有促进作用,所对应的生长率值均高于对照组的生长率值,这主要因为加入低浓度青霉素后能够抑制菌种的繁殖而不影响小球藻的生长。青霉素在0.5~5.0mg/L时可提高小球藻细胞的含量,表明低浓度(5.0mg/L)的青霉素对小球藻的长期培养是有利的。聂昌金等研究表明青霉素对试验藻生长有抑制作用,但可能没有杀灭作用。也有研究表明,低于100mg/L的青霉素对小球藻的生长有促进作用;低于25mg/L的青霉素对金藻的生长有刺激效应,藻细胞密度明显增加。这与该试验结论相符,表明不同青霉素浓度对藻生长的影响存在差异,造成这些差异的原因可能与藻种有关,但总体来说,低浓度青霉素对小球藻生长有利。2.2氨苄激素对小球藻生长的影响氨苄青霉素是一种广谱半合成青霉素类药物,毒性极低。岳伟萍研究表明氨苄青霉素在5mg/L到1000mg/L的浓度范围内对小球藻的生长无太大影响。由图2可见,添加氨苄青霉素对小球藻生长的影响较大。添加不同浓度的氨苄青霉素,均能显著抑制小球藻液中菌的生长,与对照相比,随氨苄青霉素浓度减小,生长率值均呈现上升趋势,表明氨苄青霉素对小球藻液中菌的抑制作用增强。在培养过程中,氨苄青霉素的抑菌作用效果明显,9d后,藻细胞密度剧增。添加氨苄青霉素处理组颜色均变深,且几乎无絮状残骸沉淀等现象,说明小球藻对氨苄青霉素敏感性较弱,氨苄青霉素在整个培养过程中对小球藻生长抑制作用不明显可适于小球藻培养过程抑菌。氨苄青霉素浓度越低,抑菌作用越好。2.3头孢他啶对小球藻的影响由图3可知,头孢他啶处理组的细胞密度明显高于对照组的细胞密度,说明低浓度(<10mg/L)头孢他啶的加入,可促进小球藻的生长,同时表明头孢他啶对小球藻的敏感性较弱。在培养过程中,0.5mg/L浓度下,藻液生长率呈明显增长趋势,5mg/L浓度下,对小球藻的生长没有明显影响,随着头孢他啶浓度降低,对小球藻抑菌作用越明显。随着时间推移,藻颜色逐渐变深,表明其对小球藻有一定的促进作用,但对于其抑菌机理有待进一步研究,故选取其用于藻液抑菌时慎用。2.4氨苄激素用量对小球藻的促进作用不同的抗生素对藻种的生长影响是不同的,抗生素可抑制水生细菌的繁殖,在除菌、抑菌方面表现出了强大的作用。由图4、5可以看出,3种抗生素对小球藻中菌的生长均具有不同程度的抑制作用。在培养前9d,0.5mg/L时氨苄青霉素对小球藻的促进作用很弱,生长缓慢,头孢他啶和青霉素对小球藻的促进作用较强;但总体上,0.5mg/L的促进作用比1.0mg/L的作用较弱。1.0mg/L时氨苄青霉素对藻液中菌的抑制作用最强,培养6d后,头孢他啶和青霉素对小球藻中菌的生长均具有抑制作用,对小球藻细胞生长有促进作用,但抑菌作用次于氨苄青霉素。众所周知,不同类型抗生素,因抗菌机理不同,他们对不同微生物往往呈现不同的抗菌活性。而微藻属单细胞低等植物,由少数乃至多数细胞聚集形成,由此可见,上述3种抗生素对小球藻生长呈现不同的抑制作用,是源于其不同的抑制机理。3激素的