高效液相色谱课件

高效液相色谱高效液相色谱11概述高效液相色谱法（HPLC，highperformanceliquidchromatography）发展于20世纪60年代末；它不受样品挥发性的限制，可完成气相色谱法不易完成的分析任务；适于分析沸点高、难气化、分子量大、受热不稳定的有机化合物、生物活性样品，这些化合物约占有机化合物的80％。目前，在食品、化工、医药等诸多行业被广泛地应用。1概述高效液相色谱法（HPLC，highperform2分析型HPLC,400bar制备型HPLC，大于20大气压LPLC低压柱色谱，低于5个大气压快速柱色谱（flashchromatography)2个大气压MPLC,中压柱色谱，5-20大气压1mg10mg100mg1gug各种加压液相色谱大体分离规模分析型HPLC,400bar制备型HPLC，大于20大气压3高效液相色谱与经典液相色谱比较

与经典液相色谱的工作原理相同，但使用效能却远大于经典的液相色谱；高效液相色谱又被称为现代液相色谱。高效液相色谱与经典液相色谱比较与经典液相色谱的工作原理相同4（1）高柱效：由于新型高效微粒固定相填料的使用，柱效可达30000块/m理论塔板数；（2）高灵敏度：在高效液相色谱中常使用的紫外吸收检测器的最小检测量可达10-9g，而荧光检测器的灵敏度可达10-11g，非破坏性；（3）分析速度快：由于使用了高压输液泵，输液压力可达40MPa，流动相流速大大加快，完成一个样品分析，仅需几分钟至几十分钟，与经典的液相色谱相比，分析时间大大缩短；（4）高选择性：不仅可分析有机化合物的同分异构体，使用手性固定相还可分析性质上极为相似的光学异构体。（1）高柱效：由于新型高效微粒固定相填料的使用，柱效可达305例如：分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。氨基酸分离：经典色谱法：20h分离出20种氨基酸（柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度30cm3/h）。高效液相色谱法：lh。用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，梯度洗脱，0.5h内分离出尿中104个组分。例如：6与气相色谱比较（1）缺少像气相色谱法中使用的热导检测器、氢火焰离子化检测器那样的通用型检测器；（2）使用多种溶剂，成本比气相色谱法高，而且易引起环境污染；当进行梯度洗脱操作时，比气相色谱的程序升温操作复杂；（3）不能完成柱效在10万块理论塔板数以上的、组成复杂的样品分析，也不能代替中低压柱色谱去分析受压易分解，变性的样品。与气相色谱比较（1）缺少像气相色谱法中使用的热导检测器、氢火7储液器真空脱液器高压泵自动进样器柱温箱馏分收集器检测器2高效液相色谱仪储液器真空脱液器高压泵自动进样器柱温箱馏分收集器检测器2高8由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。图1高效液相色谱仪示意图由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。9图2高效液相色谱仪示意图高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统图2高效液相色谱仪示意图高压输液系统进样系统分离系统检测10

HPLC组成主要部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。辅助装置：自动进样、馏分收集、数据处理等。

HPLC组成11HPLC工作过程：高压泵将贮液器中流动相经进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。注入欲分离样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品带入色谱柱进行分离，依先后顺序进入检测器。记录仪记录检测器送出的信号，得到液相色谱图。HPLC工作过程：12

2.1高压输液系统

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器、梯度洗脱装置和压力表等组成。（1）储液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L。2.1高压输液系统13关键部件之一。将储液罐中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。分类：恒流泵和恒压泵。恒流泵：输出流量保持恒定，与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵：能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。

高压输液泵关键部件之一。将储液罐中的流动相以高压形式连续不断地送入液路14往复泵示意图

目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。往复泵示意图目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流15过滤器设置在高压输液泵进口和出口与进样阀之间，防止输液泵柱塞和进样阀阀芯损坏，以及因柱头阻塞引起柱压升高。

溶剂过滤器、管道过滤器脉动阻尼器设置在高压输液泵出口和色谱柱进口之间，用于消除往复式柱塞泵输出的压力脉动。过滤器16梯度洗脱装置

梯度洗脱：在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂，按一定程序连续改变它们之间的比例，使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，提高分离效果，缩短分析时间。

梯度洗脱装置17外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。梯度洗脱装置分为两类：外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵182.2

进样系统

进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。2.2进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀19采样进样定量管微量注射器六通阀进样器工作原理示意图采样进样定量管微量注射器六通阀进样器工作原理示意图20手动进样阀手动进样阀21定量管接头定量管接头22

柱外展宽（柱外效应）

：色谱柱外的因素所引起的峰展宽。主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。可分柱前和柱后展宽。

高效液相色谱柱（柱长约5～30cm）比气相色谱柱短得多，所以柱外展宽较突出。

进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。柱外效应柱外展宽（柱外效应）：色谱柱外的因素所引起232.3分离系统—色谱柱

色谱柱是液相色谱的核心部件，包括柱管与固定相。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。

一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。2.3分离系统—色谱柱色谱柱是液相色谱的核心部件24

一般在分离柱前装有一个预柱，柱内填充物和分离柱完全一样，可使淋洗溶剂经过前置柱（预柱）时为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱性能不受影响。（减少不可逆吸附和固定相的流失）一般在分离柱前装有一个预柱，柱内填充物和分离柱完全一252.4检测系统

检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高、重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。

2.4检测系统检测器是液相色谱仪的关键部件之一26检测器的基本类型：溶质性检测器：仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器、蒸发光散射检测器（ELSD)等。总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光、电导检测器等。

检测器的基本类型：27高效液相色谱检测器比较？高效液相色谱检测器比较？282.5附属系统

包括脱气、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。

脱气：流动相使用前必须脱气，以除去其中溶解的气体（如O2），防止在洗脱过程中流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低产生气泡，增加基线噪音，降低灵敏度；溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。脱气方法：氦气脱气法、加热回流法、真空脱气法、超声脱气法、在线真空脱气法（膜渗透在线脱气）。2.5附属系统包括脱气、恒温、自动进样、馏分收293高效液相色谱的固定相和流动相

3.1固定相

以承受高压能力，分为刚性固体和硬胶两大类；

刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。

3高效液相色谱的固定相和流动相3.1固定相30

按孔隙深度，分为表面多孔型和全多孔型两类：表面多孔型固定相在实心玻璃球基体外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，适合做一般性样品分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。按孔隙深度，分为表面多孔型和全多孔型两类：31全多孔型固定相

由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成，也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相。这类固定相颗粒很细（5～10μm），孔较浅，传质速率快，高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成，也32

333.2流动相对流动相的基本要求：

(1)溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。

(2)溶剂要与检测器匹配。紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。

(3)折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。（4）价廉易得，无毒、环境污染小。3.2流动相对流动相的基本要求：34当小于截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂产生强烈吸收，此时溶剂是光学不透明的，严重干扰组分的吸收测量。溶剂的紫外截止波长当小于截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂产生强烈吸收，此时溶剂35（5）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～100nm。（6）化学稳定性好。不能选与样品发生反应的溶剂。

(7)适宜的沸点及粘度。溶剂沸点过高，粘度大，柱效降低；常用溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

（5）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求36

高效液相色谱中常用溶剂及物理常数溶剂紫外截止波长nm沸点/oC黏度/mPa.s(25oC)溶剂强度εo正庚烷195980.400.01正己烷190690.300.01环戊烷200490.420.05四氢呋喃212660.460.57乙酸乙酯256770.430.53氯仿245610.530.40丙酮330560.300.56乙腈190820.340.65甲醇205650.540.95水1000.89高效液相色谱中常用溶剂及物理常数紫外截止波长n374高效液相色谱法的类型按照分离机理，高效液相色谱法可分为液-固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱、离子排斥色谱、离子对色谱、离子抑制色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。主要对液-固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱进行介绍。应用最多的是液-液分配色谱。4高效液相色谱法的类型按照分离机理，高效液相色谱法可分为液384.1液-固吸附色谱(LSAC)

流动相为液体，固定相是固体吸附剂的色谱法，简称为液-固吸附色谱法。液-固吸附色谱法是最早使用的液相色谱法，是液相色谱法的基础。存在着重复性差、耗费溶剂、色谱柱再生时间长等缺点，目前的使用范围小于液-液分配色谱。4.1液-固吸附色谱(LSAC)流动相为液体，固定相是固39液-固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液-固色谱是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。液-固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的40吸附色谱中，在一定的条件（温度、压力）下，达到吸附平衡时，吸附在吸附剂表面单位面积上的溶质分子的量与该组分分布在单位体积流动相中的分子的量的比值称为吸附系数(Ka)，它相当于液-液分配色谱中的分配系数（K）。Vm代表流动相的体积；Sa

代表固定相的表面积；Xm、Xa分别代表溶质分子在流动相和固定相中的量（物质的量或质量）。4.1.1吸附系数吸附色谱中，在一定的条件（温度、压力）下，达到吸附平衡时，吸41基于不同的组分与流动相分子争夺吸附剂表面的活性中心时，因吸附系数的大小不同进行分离的，吸附系数越大，越晚流出色谱柱，保留时间越长。为了实现较好的分离，应选择适当的条件使各组分之间的吸附系数存在较大的差异。4.1.2液-固吸附色谱的分离原理基于不同的组分与流动相分子争夺吸附剂表面的活性中心时，因吸附424.1.3固定相

吸附色谱所用固定相多是硅胶、氧化铝等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。4.1.3固定相吸附色谱所用固定相多是硅胶、氧化铝等。由434.1.4流动相

一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。

在吸附色谱（硅胶）中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。4.1.4流动相一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂44溶剂ε0溶剂ε0溶剂ε0氟烷-0.25苯0.32乙腈0.65正戊烷0.00氯仿0.40吡啶0.71石油醚0.01甲乙酮0.51正丙醇0.82环己烷0.04丙酮0.56乙醇0.88四氯化碳0.18二乙胺0.63甲醇0.95常用溶剂在氧化铝吸附剂中的ε0

在硅胶吸附剂中ε0值的顺序相同。（ε0硅胶=0.77×ε0氧化铝）溶剂ε0溶剂ε0溶剂ε0氟烷-0.25苯0.32乙腈0.6545液-液分配色谱是固定相与流动相均为液体的色谱法。在一定（温度、压力）条件下，化合物在两相（固定相和流动相）间达到分配平衡时，其在固定相与流动相中的浓度的比值称为分配系数(distributioncoefficient，K)。4.2液-液分配色谱法（LLPC）式中，Vm

和Vs代表流动相和固定相的体积；Xs、Xm代表溶质分子在流动相和固定相中的量（物质的量或质量）,Cm和Cs溶质分子在流动相和固定相中的浓度。液-液分配色谱是固定相与流动相均为液体的色谱法。在一定（温度46分配系数与分析物的化学结构、所用流动相和固定相的性质有关，也与温度、压力有关。在流动相、固定相、温度和压力等条件一定时，若样品浓度很低（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度的增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。分配系数与分析物的化学结构、所用流动相和固定相的性质有关，也474.2.1分离原理液-液分配色谱是基于各组分在固定相和流动相之间的分配系数（K）的大小来分离的。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中的滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提，各组分间的分配系数相差越大，越容易分离。实际分析中,当固定相确定后，主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。4.2.1分离原理液-液分配色谱是基于各组分在固定相和流动48

4.2.2固定相

由于液-液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液β,β′-氧二丙腈，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。

4.2.2固定相49

为解决固定液在载体上流失问题，产生了化学键合固定相，将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面。它代替了固定液的机械涂渍，对液相色谱法迅速发展起着重大作用，是液相色谱法的一个重大突破。

化学键合固定相是目前应用最广泛的一种固定相。约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。为解决固定液在载体上流失问题，产生了化学键合固定相，将各50按照固定相与流动相的极性差别，液-液色谱法可分为正相色谱和反相色谱两类。4.2.3正相色谱和反相色谱按照固定相与流动相的极性差别，液-液色谱法可分为正相色谱和反51正相色谱

流动相的极性小于固定相的极性的液-液分配色谱，也称为正相洗脱。正相洗脱中，样品中极性小的化合物在固定相中溶解度小，分配系数小，先流出色谱柱，而极性大的化合物后流出色谱柱。正相色谱流动相的极性小于固定相的极性的液-液分配色谱，也称52反相色谱（reversephase,RP）流动相的极性大于固定相的极性的液-液分配色谱，也称为反（逆）相洗脱。反相洗脱与正相色谱法相反，样品中极性大的化合物先流出色谱柱，而极性小的化合物在固定相中溶解度大，分配系数大，后流出色谱柱。因为反相色谱中固定液更易流失、重复性差，目前也已被反相化学键合相色谱法代替。反相色谱（reversephase,RP）流动相的极性大534.2.4化学键合相色谱法（CBPC）

采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。

4.2.4化学键合相色谱法（CBPC）采用化学键合相54(1)键合相色谱的优缺点优点：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。在高效液相色谱法中，约有8O％的分离问题是用键合相色谱法解决。缺点：不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。

(1)键合相色谱的优缺点优点：通过改变流动相的组成和种类，可55(2)键合固定相类型：

用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类：（1）疏水基团

(非极性键合相),如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等。（2）极性基团如氨丙基、氰乙基、醚和醇等。

(3)中等极性键合相,如醚基键合相，可用于正相色谱，也可用于反相色谱，具体情况要依流动相的极性而定。（4）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。(2)键合固定相类型：56反相键合色谱法

固定相采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37、硅胶-苯基等，流动相采用极性较强的溶剂，如甲醇-水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲溶液等；多用于分离多环芳烃等低极性化合物。键合不同长度的烃基的固定相亲脂性强弱顺序：RP-18(C18H37)>RP-8(C8H17)>RP-2(C2H5)。

RP:reversephase反相键合色谱法固定相采用极性较小的键合固定相，如硅57亲水性表面亲油性表面化学修饰RP-2RP-8RP-18硅胶亲水性表面亲油性表面化学修饰RP-2RP-8RP-18硅胶58

采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，可用于分离极性化合物；若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，可分离易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，可用于分离59反相键合相色谱的分离机理

疏溶剂作用：键合在硅胶表面上的非极性烷基键合相具有较强的疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。反相键合相色谱的分离机理疏溶剂作用：键合在硅胶表面上的非极60反相色谱中固定相表面上

溶质分子与烷基键合相间的缔合作用反相色谱中固定相表面上

溶质分子与烷基键合相间的缔合作用61氰基键合相及氨基键合相是常用极性键合相，其次还有双羟基键合相及乙二醇键合相等。由于具有较强的极性，常作为正相色谱法使用，与硅胶吸附色谱法相似，常选择烷烃（正己烷）加适量极性调节剂作流动相。正相键合相色谱法

氰基键合相及氨基键合相是常用极性键合相，其次还有双羟基键合相62氰基固定相氰基固定相是将氰乙烷基（CN-CH2CH2-Si-)键合在硅胶上制备而成。使用氰基键合相时，分离条件与硅胶相似，但氰基键合相的极性比硅胶弱，用相同流动相时，保留值在氰基键合相上较小。氰基键合相对双键异构体分离的选择性好于硅胶固定相。氰基固定相氰基固定相是将氰乙烷基（CN-CH2CH2-Si-63氨基键合相

氨基键合相是将氨丙烷基(NH2-CH2CH2CH2-Si-)键合在硅胶载体上，形成单分子层，键合量约为3.2μmol/m2。氨基键合相与硅胶性质差别较大，前者为碱性后者为酸性。氨基键合相可用于正相色谱，也可用于反相色谱，视固定相与流动相的相对极性而定。用于正相色谱时，常与硅胶柱具有不同的选择性。氨基键合相是糖类分离的最重要色谱柱，又称为碳水化合物柱，此时作为反相色谱使用，用乙腈-水为流动相。氨基键合相

氨基键合相是将氨丙烷基(NH2-CH2CH2CH64离子性键合相色谱法

当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如－SO3H、－CH2NH2、－COOH、－CH2N(CH3）2等时，就形成了离子型键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类似。

离子性键合相色谱法当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基65

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4.3离子交换色谱法（IEC）

离子交换色谱是以离子交换树脂为固定相，用水作流动相的一种高效液相色谱分离法。离子交换色谱适于分离在水溶液中能够电离的物质。离子交换色谱在20世纪60年代开始兴起，但其发展比较缓慢，不如其它类型高效液相色谱应用广泛，有些应用已被离子对色谱或离子色谱代替。4.3离子交换色谱法（IEC）离子交换色谱是以离子交换67（1）分离原理

在离子交换树脂的网状结构骨架上，具有许多带有正电荷或负电荷可与溶液中的离子进行交换的活性基团，样品分子在水溶液中电离成的离子，可与离子交换树脂上与其带相同电荷的离子发生交换反应：

当交换反应达到平衡时，其平衡常数可用下式计算：

（1）分离原理

在离子交换树脂的网状结构骨架上，具有许多带有68离子交换色谱是基于各组分在离子交换树脂上的结合能力差别进行分离的。平衡常数大的组分，与离子交换树脂的结合强，后流出色谱柱；反之，平衡常数小的组分，与离子交换树脂的结合弱，先流出色谱柱。离子交换色谱是基于各组分在离子交换树脂上的结合能力差别进行分69（2）固定相

离子交换色谱的固定相包括多孔型离子交换树脂、薄壳型离子交换树脂和化学键合型离子交换树脂三种。多孔型离子交换树脂是在苯乙烯和二乙烯基苯交联共聚形成的网状结构基体上引入各种交换基团制成的球形微粒。这种树脂交换基团多，柱容量大，对温度稳定性好，但由于基体中有孔，扩散速度慢、在有机溶剂中或水中易于溶胀，柱效较低。（2）固定相

离子交换色谱的固定相包括多孔型离子交换树脂、薄70高效液相色谱课件71薄膜型离子交换树脂是以薄壳玻珠为担体，在其表面上涂上约1%的离子交换树脂。这种离子交换树脂具有传质速度快、柱效高、不易溶胀的优点，但因可交换层薄，载样量小。化学键合型离子交换树脂，又称为离子交换剂，是把离子交换基团如季胺基团、磺丙基和羧基等直接键合在硅胶上制备而成。化学键合型离子交换树脂膨胀性很小并可耐受较高的压力。薄膜型离子交换树脂是以薄壳玻珠为担体，在其表面上涂上约1%的72（3）流动相离子交换色谱一般用含盐的缓冲液（如磷酸盐、柠檬酸盐等）作为流动相,有时也加入能与水混溶的有机溶剂（如甲醇、乙腈等）。流动相的离子强度、pH、盐的种类及浓度、是否含有机溶剂及有机溶剂种类，均会对样品的保留产生影响。（3）流动相离子交换色谱一般用含盐的缓冲液（如磷酸盐、柠檬酸734.4离子色谱法（IC）

由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。4.4离子色谱法（IC）由离子交换色谱法派生出来的一种分74

为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测75

4.5离子对色谱法（IPC）

离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。它是离子对萃取技术与色谱法相结合的产物。在20世纪70年代中期，Schill等人首先提出离子对色谱法，后来，这种方法得到十分迅速的发展。4.5离子对色谱法（IPC）离子对色谱法是分离分析强76将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。离子对色谱法原理将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）77

4.6尺寸排阻色谱法（SEC）

尺寸排阻色谱法(Sizeexclusionchromatography)又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。4.6尺寸排阻色谱法（SEC）尺寸排阻色谱法(S78

尺寸排阻色谱被广泛应用于分析大分子物质相对分子质量的分布。特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。（2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器。（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。尺寸排阻色谱被广泛应用于分析大分子物质相对分子质量的79

分离原理按分子大小顺序进行分离。其固定相为化学惰性多孔物质——凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴。体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。分离原理80高效液相色谱课件81

4.7亲和色谱法(Affinitychromatography,AC）

亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。

在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的间隔臂（如环氧、联氨等）；再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。4.7亲和色谱法(Affinitychromatogr82

亲合色谱法示意图亲合色谱法示意图83

5高效液相色谱法的选择1分离类型的选择

高效液相色谱法有多种分离类型，分析前首先应根据样品的性质进行选择，标准液相色谱类型（液-固、液-液、及离子交换色谱）最适合的分子量范围是20O～2000;如对于分子量较大且各组分的分子量间存在较大差别的样品，应考虑排阻色谱；对于可电离的化合物可考虑用离子交换色谱。化学键合相液-液分配色谱应用得最为广泛，据统计3/4的HPLC分离工作是用以C18（ODS）、C8为固定相的反相高效液相色谱完成的，对于分子量<2000的样品，反相高效液相色谱是最常用且非常有效的分离方法。5高效液相色谱法的选择1分离类型的选择84

液相色谱分离类型选择参考表

相对分子质量＞2000

不溶于水样品

相对分子质量溶于水，＜2000不离解

溶于水，可离解溶于水:离子与非离子：反相离子对色谱

溶于水———排阻色谱，水为流动相不溶于水———排阻色谱，非水流动相同系物———分配色谱异构体——吸附色谱分子大小差异——排阻色谱反相液-液色谱排阻色谱，水为流动相碱：阳离子交换色谱酸：阴离子交换色谱

液相色谱分离类型选择参考表溶于水———排阻色85如何反相高效液相色谱分离？要求样品在极性溶剂中能够溶解。对于可电离的低分子量化合物，常通过加入弱酸、弱碱调节流动相pH的方法，使样品分子以非解离型进行分离。但应注意流动相的pH应在固定相允许使用的范围内，因强碱性条件下会破坏固定相的基质。在极性溶剂中有一定溶解的中等极性样品，仍可采用反相高效液相色谱进行分离。在极性溶剂中不能溶解的非离子型弱极性的样品，需用有机溶剂为流动相的硅胶吸附色谱或以极性键合相（如氨基或氰基键合相）为固定相的正相色谱进行分离。如何反相高效液相色谱分离？要求样品在极性溶剂中能够溶解。对于862分离条件的选择式中R——液相色谱分离度；n-柱效率，用理论塔板数来表示；a-溶剂效率，用固定相对某两个混合物的分离能力来表示；K-容量因子（分配系数），在平衡状态下组分在固定相的量与在流动相中的量的比值。2分离条件的选择式中R——液相色谱分离度；n-柱效率，用理87提高分离度，可采用如下途径：（1）增加n。其他条件相同的情况下，增加n可以使色谱峰变窄。这可通过增加柱长或选用高效能的固定相来实现，但柱长增加分离时间也会增加，因而通过选用高效能的固定相较好。（2）增加a和K，即增大各组分在固定相上的保留时间差来提高分离度。a值的增加可通过选择合适的固定相种类，提高固定相的选择性或改变流动相的组成来达到。当改变流动相的组成时，K值就随之改变。

K减小，色谱峰向前移，分离度降低；K增加，色谱峰的流出时间增加，同时峰形变宽，分离度提高。但若K过大，不但分离时间拖得很长，而且峰形变平坦，影响分辨率和检出灵敏度，K的有效范围以a<K<5为宜。

提高分离度，可采用如下途径：（1）增加n。其他条件相同的情况88高效液相色谱中常用“梯度洗脱”法，即在