目的基因的克隆课件

基因重组、基因诊断和基因治疗

GeneticRecombination,Geneticdiagnosisandgenethereapy第十五章目录基因重组、基因诊断和基因治疗第十五章目录1第一小节

DNA的重组

DNARecombination

第一小节

DNA的重组

DNARecomb2DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用

(transduction)转座

(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(t3第一小节

重组DNA技术DNARecombinationTechnique第一小节

重组DNA技术DNARecombinati4重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试5相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组DNA技术与医学的关系本节主要内容相关概念本节主要内容6一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆一、重组DNA技术相关概念克隆(cl7技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

细胞克隆个体克隆（动物或植物）技术水平：分子克隆(molecularclone)8DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆9生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目10（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸内切酶11重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功12限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶定义GGATCCGGATCC+BamHⅠ13作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）作用分类14第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名HindⅢ15Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)16BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC17（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN18（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA（四）基因载体定义常用载体19克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。克隆载体(cloningvector)20载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。载体的选择标准能自主复制；211.质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。1.质粒(plasmid)特点22目录目录23目的基因的克隆课件24λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌体DNA改造系统2.噬菌体(phage)M13噬253.粘性质粒(cosmid)3.粘性质粒(cosmid)26酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他酵母人工染色体其他27二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

二、重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受28以质粒为载体的DNA克隆过程目录以目录29（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的获取1.化学合成法30*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序31组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因目录组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分32限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcosc33mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子34（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接（二）克隆载体的35BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC36不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg372.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端2.平端连接38目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体39受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件导入方式（四）重组DNA导入受体菌40（五）重组体的筛选

1.直接选择法(1)

抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选41(插入失活法)抗药性标记选择目录(插入失活法)目录42重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基43重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源44（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。三、基因重组的意义（二）生物制药（一）疾病基因的发现与克隆三、基因重组的意义（二）生物制药45重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱目录重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激46基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断基本过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物47标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。标准48方法：.限制性酶切片段多态性分析；.分子杂交技术.聚合酶链式反应（PCR)方法：49

分子杂交与印迹技术

MolecularHybridization&BlottingTechnology

分子杂交与印迹技术

MolecularHybridiza50核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)

。一、分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交(nucleicacidhybridiza51复性RNADNA复性RNADNA52（一）印迹技术（二）探针技术

探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

（一）印迹技术探针(probe)53二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术

(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析

(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Southe54

其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)其他55三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较56分子杂交实验①②③目录分子杂交实验①②③目录57放射自显影照片目录放射自显影照片目录58

生物芯片技术BiologicalChipTechnology

BiologicalChipTechnology59DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上

。一、基因芯片基因芯片(genechip)DNA芯片(DNAchip)一、基因芯片基因芯片(gen60目录目录61是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当62

聚合酶链反应

PolymeraseChainReaction

聚合酶链反应

PolymeraseChai63