荧光分析法现代表征方法与技术-朱昌青课件

荧光分析法现代表征方法与技术------FluorescenceAnalysis

1荧光分析法现代表征方法与技术------Fluorescen《荧光分析法》第三版

许金钩、王尊本主编，科学出版社参考书《PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy》(II、III),

J.R.Laowisz,

KluwerAcademic/PlenumPublisher

2《荧光分析法》第三版参考书《PrinciplesofFl一、分子荧光的产生过程二、荧光的产生与分子结构的关系三、影响荧光强度的因素第一节分子荧光原理

Principle

ofFluorescence3一、分子荧光的产生过程第一节分子荧光原理Pri一、仪器与结构流程二、激发光谱与荧光光谱

三、荧光分析法和应用

第二节分子荧光分析法FluorescenceAnalysis

4一、仪器与结构流程

第二节分子荧光分析法Fluoresc一、荧光的产生过程

LuminescenceProcessofMolecularFluorescence*分子能级比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级；*基态→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；*激发态→基态：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；1.分子能级与跃迁5一、荧光的产生过程

LuminescenceProce2.电子激发态的多重度*大多数有机分子的基态处于单重态；*电子激发态有单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向

M=2S+1，S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；*根据洪特规则，平行自旋（三重态）比成对自旋（单重态）稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低；

S0→T1

属于禁阻跃迁，需要通过其他途径进入，而且进入的几率小；

62.电子激发态的多重度*大多数有机分子的基态处于单重态；3.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间窜越振动弛豫无辐射跃迁73.激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫8S2S1S0T1吸发发系间窜跃内转换振动弛豫能l2l1l非辐射能量传递过程

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。

内转换：同多重态电子能级中,不同能级间的无辐射能级交换

通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；

外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。9非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式辐射能量传递过程

S0→激发→振动弛豫→内转移→系间窜跃→振动弛豫→T1

S0磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1

→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：发光速度很慢：10-4～10s，即光照停止后，可持续一段时间。荧光发射：第一激发单重态的最低振动能级→基态（S1→S0跃迁）

10-7～10-9s（S0

→T1禁阻跃迁）10辐射能量传递过程S0→激发→振动弛豫→内转移→系速率竞争决定光活化电子能量迁移的途径！荧光的光物理本质11速率竞争决定光活化电子能量迁移的途径！荧光的光物理本质11二、荧光的产生与分子结构的关系

RelationBetweenFluorescenceandMolecularStructure1.荧光量子产率荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；

kF主要取决于化学结构，而Ski则主要取决于化学环境，同时也与结构有关。大多数荧光物质的量子产率在0.1~1之间。12二、荧光的产生与分子结构的关系

RelationBetw2.有机化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高。这是因为→*跃迁的摩尔吸收系数比n→*大，且→*跃迁的寿命比n→*要短。（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。重原子效应。132.有机化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光1414强荧光物质往往具备以下特征：具有大的共轭p键结构；具有刚性平面结构；具有最低的单线电子激发态S1为pp*型取代基团为给电子取代基小结：15强荧光物质往往具备以下特征：具有大的共轭p键结构；小结：

1.荧光强度和溶液浓度的关系

荧光强度

If正比于体系吸收的激发光的光强，即：

If=K’(I0-I)由朗-比耳定律：I/I0=10-

bc代入，得：

If=K’I0(1-10-

bc)将此式展开，即三、影响荧光强度的因素

低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。浓度很低时，ebc<0.05，则可近似写成：

If

=2.3

I0

lc=Kc定量分析的基础161.荧光强度和溶液浓度的关系三、影响荧光强度的因素

2.溶剂的影响溶剂的介电常数越大，荧光峰的波长越长，荧光效率越大；含有重原子的溶剂（碘乙烷）中，由于重原子效应，使荧光减弱；溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。3.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加,从而导致荧光强度的下降。

影响荧光强度的外部因素172.溶剂的影响影响荧光强度的外部因素174.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；有荧光无荧光无荧光有荧光pH<2无荧光7~12蓝色荧光

>13无荧光184.溶液pH有荧光无荧光无荧光有荧光pH<2无荧光

自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。碰撞猝灭是荧光熄灭的主要原因。5.荧光的熄灭氧的熄灭作用等。浓度越大、温度越高，碰撞机会越大粘度越大，碰撞机会越小19自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与一、仪器结构流程

测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器、记录装置。

特点：（与UV-vis仪器的比较）有两个单色器，光源与检测器通常成直角。两个单色器分别是：1）选择激发光波长的第一单色器2）选择发射光(测量)波长的第二单色器20一、仪器结构流程测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激2121检测器：光电倍增管。样品池：材料：与UV-vis吸收池相同。形状：？光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)氙灯：连续光源，发射光束强度大。波长范围：200~700nm,在200~400nm波段内，光谱强度几乎相等。22检测器：光电倍增管。样品池：材料：与UV-vis吸收池形状：仪

器

光

路

图23仪

器

光

路

图23二、激发光谱与荧光光谱

ExcitationSpectrumandFluorescenceSpectrumIf–λex

(固定λem)光源第一单色器第二单色器激发荧光样品池检测系统1.荧光的激发光谱曲线2.荧光的发射光谱曲线（荧光光谱）If–λem(固定λex)24二、激发光谱与荧光光谱

ExcitationSpectr粗步设定λex，扫描λem萘的激发、荧光光谱λexλem相对强度固定λem（最佳），扫描λex固定λex（最佳），扫描

λem荧光（发射）光谱曲线II荧光激发光谱曲线II荧光（发射）光谱曲线IIIIIIII25粗步设定λex，扫描λem萘的激发、荧光光谱λexλem相3.激发光谱与发射光谱的关系

(1)Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

(2)发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。263.激发光谱与发射光谱的关系(1)Stokes位移24.测定波长的选择瑞利散色和拉曼散色274.测定波长的选择瑞利散色和拉曼散色27三、荧光分析方法与应用1.特点（1）结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3）试样量少，应用范围广。（4）灵敏度高分析物浓度范围：10-5～

10-8mol/L，检测下限：0.1～0.1

g/cm-3比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级。

28三、荧光分析方法与应用1.特点28定性方法任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的基础。定量方法

If

=2.3

I0bc

=Kc2.定性、定量方法29定性方法任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。3.荧光分析法的应用(1)无机、有机化合物的分析在紫外光照射下能产生荧光的无机物极少，难以利用其自身的荧光来进行测定。通常采用与有机试剂形成配合物后测量，或通过其对荧光试剂的荧光增强或猝灭效应进行测定。目前可测量元素已有约60多种。无机化合物（荧光）试剂荧光增强法荧光猝灭法303.荧光分析法的应用(1)无机、有机化合物的分析无机化合物（3131但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素，并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。尿液中维生素B2的测定维生素B2（核黄素）在430-440nm蓝光照射下会发出绿色荧光，λem为535nm。它在pH6-7的溶液中荧光强度最大，而在pH11时荧光消失；32但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMn荧光法测定抗坏血酸33荧光法测定抗坏血酸333434(2)生物、医学研究内源荧光与外源探针35(2)生物、医学研究内源荧光与外源探针35蛋白荧光36蛋白荧光36膜探针37膜探针37核酸探针38核酸探针38分子灯标

（molecularbeacons）39分子灯标（molecularbeacons）39分子传感器

（molecularchemosenors）40分子传感器（molecularchemosenors）4荧光共振能量转移（FRET）系统41荧光共振能量转移（FRET）系统41GFP是一种在395nm的激发光下可以释放出绿色荧光的蛋白，现已广泛的应用于生物以及医学研究。该蛋白可以表达在真核细胞中，在和其他基因融合表达的情况下，可以活体示踪目的蛋白的定位以及活动.42GFP是一种在395nm的激发光下可以释放出绿色荧光的蛋白，通过跟踪发出的绿光来观察病毒在宿主体内的扩散途径；或者把GFP接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动