高效液相实验报告

化学与环境化学科学学院分析化学骆洪伟20144015016高效液相实验报告实验目的了解高效液相的实验原理。学习并掌握高效液相色谱仪(HPLC)的操作步骤。实验原理高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。HPLC的介绍及操作步骤高效液相色谱仪主要包括高压输送系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统及梯度洗脱等辅助装置。其工作流程如图1所示。高压输液系统高压进样系统的作用是提供足够恒定的高压，使流动相以稳定的流量快速渗透通过固定相。高压输液系统由贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置组成，其核心部件是高压泵，要求高压泵具有输出压力(1.5×107～4.5×107Pa)，输出流量恒定(精度0.1mL·min-1)，流量设定范围可调。梯度洗脱装置的作用是在分离过程中，按一定程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极性、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确度。此外，还附有加热脱气、超声波脱气等装置，以排除溶解在流动相或试样中的气体。进样系统在高效液相色谱中，一般采用旋转式六通阀于高压下进样。采用旋转式六通阀进样的优点是进样量可变范围大，耐高压，宜于进样自动化，但易造成色谱峰柱前扩展。分离系统液相色谱柱一般采用内壁抛光的优质不锈钢管或厚壁玻璃管。为使工作压力不致过高，柱长都比较短，一般在5～30cm，柱径为4～5mm。柱子的填充取决于柱填料的性能，对于生物胶或离子交换树脂等，因遇到溶剂会膨胀，所以必须采用匀浆湿法填充。为防止颗粒大的填料先沉降而产生分层现象，可采用等密度溶剂(四氯乙烷和四氯乙烯混合物)配成匀浆。用高压泵将其快速压入装有流动相的色谱柱中，经冲洗后，即可使用。检测记录系统高效液相色谱检测器要求具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体积小等特点，且对温度和流量的变化不敏感。目前，液相色谱常用检测器有紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光检测器和电化学检测器等。HPLC操作步骤过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10mL·min-1。调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。设计走样方法。点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。关机时，先关计算机，再关液相色谱。登记。注意事项泵的使用和维护注意事项为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜（0.2µm或0.45µm）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障：①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。②压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。梯度洗脱在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。溶剂过滤头的清洗①取下过滤头放在(1:4,V/V)的硝酸溶液烧杯中超声清洗15分钟；②取出后用蒸馏水超声清洗10分钟；③用吸球吹出过滤头中的液体；④再用蒸馏水超声清洗10分钟；⑤用吸球吹净过滤头中的水份；⑥将过滤头重新插入溶剂瓶中(正相系统注意将过滤头烘干)。流动相的更换①将新流动相置于储液瓶