兽药残留快速检测课件

模块4兽药残留快速检测

模块4兽药残留快速检测兽药和兽药残留的定义兽药

指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质（含药物饲料添加剂）。

兽药残留指给畜禽使用兽药或添加剂后，药物以其原形及其代谢产物的形式蓄积或储存在动物的细胞、组织、器官或可食性产品（如蛋、奶）中。

兽药和兽药残留的定义兽药指用于预防、治疗、诊断兽药的分类抗生素、磺胺药类、呋喃药类、抗球虫药、激素药类和驱虫药兽药的分类抗生素、磺胺药类、呋喃药类、抗球虫药、激素药类和驱兽药残留带来的食品安全问题Textinhere多宝鱼瘦肉精兽药残留带来的食品安全问题Textinhere多宝鱼瘦肉兽药残留的快速检测分析一、盐酸克伦特罗检测卡1适用范围

此方法应用于猪肉、内脏和猪尿液中盐酸克伦特罗含量的检测。兽药残留的快速检测分析一、盐酸克伦特罗检测卡2检测原理

本试剂运用抗原抗体的特异反应以及侧向层析和胶体金技术进行样品中克伦特罗分子的快速定性检测。用BSA(牛血清白蛋白)偶联的克伦特罗分子与胶体金颗粒结合后，包被在醋酸纤维素膜上；在硝酸纤维素膜上将克伦特罗抗体和BSA抗体分别包被在检测区（T）和质控区（C）。当样本加到加样孔后，样本中的克伦特罗分子与克伦特罗-BSA-胶体金偶联物一起层析泳动到检测区竞争与克伦特罗抗体结合，剩余的克伦特罗-BSA-胶体金继续泳动到质控区与抗体结合。因此，当样本中的克伦特罗浓度超过一定量后，胶体金偶联物就不能与克伦特罗抗体结合，此时检测区不出现紫红色线条；当样本中克伦特罗浓度低于一定值或样本中没有克伦特罗时，胶体金偶联物就与克伦特罗抗体结合，从而在检测区显示出一条紫红色线条；而无论样本中是否含有克伦特罗分子，质控区都会出现紫红色线条，以示检测有效。2检测原理3主要仪器

食品加工机，低速离心机，电子秤（精度0.1克），250ul单道微量移液器（移液枪）。4材料与试剂

克伦特罗胶体金法检测卡，检测试剂A（3%三氯乙酸溶液），检测试剂B（0.1N氢氧化钠溶液），pH试纸（1-14），剪刀，10ml试管（或离心管），一次性塑料吸管、一次性手套等。3主要仪器5操作步骤（1）从原包装铝箔袋中取出检测卡，在1小时内应尽快地使用；（2）将肉或内脏样本用剪刀剪成碎条后放入食品加工机中用一字刀粉碎，秤取5g粉碎样本置于试管中，加入5毫升检测试剂A。盖上盖，摇匀，浸泡约10分钟；（3）用离心机离心装有浸泡液和样本的试管2分钟（3000rpm），用移液枪移取250μl上清液转移入2ml检测管中，加入极少量检测试剂B，调整pH值至7左右；（4）将盐酸克伦特罗检测卡片置于干净平坦的台面上，用塑料吸管垂直滴加3滴无空气样品处理液于加样孔内；（5）等待紫红色条带的出现，测试结果应在5分钟时读取。5操作步骤6结果判定阳性（+）：仅质控区（C）出现一条紫红色条带，在测试区（T）内无紫红色条带出现；阴性（-）：两条紫红色条带出现。一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区（C）内；无效：质控区（C）未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏，应重新测试1次，如仍为此现象，应更换检测卡或联系供应厂家；阳性结果表明盐酸克伦特罗含量在阈值以上，阴性结果表明盐酸克伦特罗含量在阈值以下。6结果判定7灵敏度

灵敏度（阈值）：根据每种检测卡控制浓度而定，盐酸克伦特罗有3ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml和50ng/ml等控制规格，判断前请向供应厂家咨询控制阈值。7灵敏度8注意事项（1）肉及内脏中脂肪会导致假阳性结果，取样时请剔除肉眼可见的脂肪；（2）盐酸克伦特罗检测卡应在常温下使用，不用对刚屠宰的猪肉或冷冻猪肉直接进行检测；8注意事项克伦特罗ELISA检测1适用范围

此方法应用于猪肉、内脏、猪尿液及饲料中盐酸克伦特罗含量的检测。克伦特罗ELISA检测1适用范围二、使用单位需自备的设备及试剂

1、设备：┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm┅┅振荡器┅┅离心机┅┅天平：感量0.01g┅┅刻度移液管：10ml┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、50ml┅┅微量移液器：单道20

l～200

l、100

l～1000

l二、使用单位需自备的设备及试剂试剂：┅┅甲醇(分析纯)┅┅氢氧化钠(分析纯)┅┅浓盐酸┅┅蒸馏水试剂：三、提供的材料与试剂

1、96孔酶标板×1块2、标准品×6瓶：(1ml/瓶）

0ppb,0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1ppb3、高浓度标准品：100ppb（1ml/瓶）4、克伦特罗酶标物…………6ml5、克伦特罗抗试剂…………9ml6、底物液A液………6ml7、底物液B液………6ml8、终止液…………6ml9、浓缩洗涤液(10×)……40ml10、克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)…………40ml三、提供的材料与试剂四、溶液的配制

配液1:样品稀释液用去离子水将克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)按1:1体积比进行稀释，即：1份克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)+1份去离子水；用于提取样本的稀释，样品稀释液在4℃环境可保存一个月。配液2:洗涤工作液用去离子水将浓缩洗涤液(10×)按1:9体积比进行稀释，即：1份浓缩洗涤液(10×)+9份去离子水；用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。配液3:1M氢氧化钠溶液称取4.0g氢氧化钠加去离子水混匀溶解定容至100ml。配液4:0.1M盐酸溶液量取0.83ml浓盐酸加去离子水混匀定容至100ml配液5：25%甲醇溶液将25ml无水甲醇加入到75ml去离子水中并充分混匀配液6：组织样本提取液

80ml25%甲醇溶液加20ml0.1M盐酸四、溶液的配制五、样本前处理步骤

样本处理前须知：（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。（b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。（c）未处理的样本需冷冻保存。（d）处理后的样本可在2-8℃避光保存24h。（一）组织（带有低脂肪的肉、肝）----称取2.0±0.05g匀浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中；----加入6ml组织样本提取液，用振荡器振荡摇；----4000r/min离心5min；----取1ml上清液,加入10μl1M氢氧化钠溶液混匀（混匀后测定pH值，大约为8）；----4000r/min离心5min；----取上清液20

l用于分析。五、样本前处理步骤（二）尿液----取20

l清亮尿样直接测定（如尿样浑浊须经过滤或3000g以上，15℃离心10min直至清亮），暂不使用的样本需冷冻保存。（三）饲料前处理方法----用均质器均质饲料样本；----称取1±0.05g均质样本至50ml离心管中，加0.1MHCL溶液10ml，用振荡器剧烈振荡5min，4000r/min以上离心5min；----取1ml上清液,加入1M氢氧化钠溶液混匀（大约40μl~70μl，混匀以后测定pH值，大约为8）；----4000r/min离心5min；---将上清液用样品稀释液五倍稀释（即：1份上清液+4份稀释后的样品稀释液）并充分混匀----取20

l用于分析。（二）尿液六、检测步骤测定前应须知：1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20～25℃）。2、使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。六、检测步骤操作步骤：

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本：加标准品/样本20

l/孔到对应的微孔中，再加入克伦特罗酶标物50

l/孔，再加入克伦特罗抗试剂80ul/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。操作步骤：`

6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液200

l/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。7、显色：加入底物液A液50

l/孔，再加底物液B液50

l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。8、测定：加入终止液50

l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。`6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作七、检测方法灵敏度、准确度、精密度试剂盒灵敏度：0.1ppb样本最低检测限：组织样品………0.3ppb尿液样品………0.1ppb饲料样品……5ppb七、检测方法灵敏度、准确度、精密度`八、注意事项

1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需将其摇匀。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。`八、注意事项

6、储存条件保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于