高效液相色谱串联质谱法快速分析烟草中有机磷、杂环和酰胺类农药残留

高效液相色谱串联质谱法快速分析烟草中有机磷、杂环和酰胺类农药残留

现在，随着公众吸烟安全意识的提高，控制香烟中农药残留量变得越来越紧迫和重要。由于具有高效、易降解、使用方便等优点,有机磷农药是全世界范围内应用最为广泛的一类高效杀虫剂,品种多达百余种。目前有关烟草中有机磷类农药残留检测方法的研究并不多。气相色谱法(GC)在有机磷类农药残留分析中的应用最为广泛。灵敏度高、选择性好的气相色谱串联质谱方法(GC-MS)已经在有机磷类农药残留分析中得到普遍应用。杂环和酰胺类农药的数量相对较少,目前国内关于其残留检测的文献报道也很少。将高效液相色谱法分离热不稳定、难挥发或强极性化合物的优点和质谱的高选择性、高灵敏度结合在一起的LC-MS/MS联用技术,在不适于用GC或GC-MS分析测定的有机磷类农药如蚜灭磷、敌百虫等的分析检测方面显示了其优越性。Anastassiades等于2003年提出一种用来检测食品蔬果中农药多残留体系的方法,即QuEChERS方法(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,andSafe)。其前处理主要采用乙腈提取,分散固相萃取净化,操作快速、环保、简便,具有广阔的应用前景。Steven等验证了用QuEChERS方法结合GC-MS或LC-MS/MS方法可用来检测水果和蔬菜中的229种农药的残留。黄琪等用QuEChERS前处理方法结合LC-MS/MS方法检测了烟草中15种有机磷类农药的残留量。本文采用QuEChERS前处理方法,用LC-MS/MS分析了烟草中的38种农药残留。该方法操作简便,成本低廉,灵敏度高,且扩充了分析对象,非常适合于大量样品的快速分析,可为当前烟草中农药多残留体系的进一步研究提供试验参考。1材料和方法1.1仪器、仪器和吸附剂Agilent1200高效液相色谱系统(美国安捷伦公司);API4000三重四极杆串联质谱仪(美国应用生物系统公司);Analyst1.4.2系统采集并处理数据;MilliQ50超纯水仪(美国MILLIPORE公司);CP2245电子天平(感量0.0001g,德国Sartorius公司);SIGMA1-15PK高速离心机(德国Sigma公司);0.45μm有机相针式滤器(上海安谱科学仪器有限公司);1.5mL和50mL离心管(美国安捷伦公司);KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山仪器公司);色谱柱WatersdC18(150mm×2.1mm,3μm,美国Waters公司)。甲醇(色谱级,美国J.T.Baker公司);乙腈(色谱级,美国ROE公司);氯化钠(分析纯)、无水硫酸镁(分析纯)、柠檬酸钠(分析纯)、柠檬酸氢二钠(分析纯)、PSA吸附剂(primarysecondaryamine,即N-丙基乙二胺键合固相吸附剂),均购自美国安捷伦公司。农药标准品:农药标准品分别购自德国Dr.Ehrenstorfer公司和Sigma公司。1.2硫酸镁标准溶液的制备准确称取2.0g烟末至50mLTeflon离心管中,加入10mL超纯水(适度振荡,保证浸润充分)静置10min,然后加入10mL乙腈溶液,手持振荡1min,再加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸氢二钠,立即手持振荡2min(防止无水硫酸镁结块),于4000rpm离心10min。离心后,移取上清液乙腈层1mL于已加入150mg无水MgSO4和25mgPSA的1.5mL离心管中,手持振荡2min,之后以6000rpm离心2min,吸取上清液200μL,用流动相稀释至1mL,经0.45μm滤膜过滤后用于分析。所有样品均即配即用。1.3水质条件及质谱条件色谱条件:WatersdC18色谱柱(150mm×2.1mm,3μm,美国Waters公司);柱温:25℃;流速:0.2mL/min;进样量:10μL;流动相A:水;流动相B:乙腈;流动相洗脱梯度:B初始体积分数为10%;0-1min,B线性增加至50%;1-4min,B线性增加至70%;4-10min,B线性增加至90%;10-12min,回到初始状态,并保持8min。质谱条件:离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正离子扫描;检测方式:多级反应监测(MRM);电喷雾电压(IonSprayVoltage,IS):5500V;雾化气流速(GS1,N2):60psi;辅助加热气流速(GS2,N2):50psi;碰撞气流速(Collisiongas,CAD,N2):8psi;气帘气流速(Curtaingas,CUR,N2):10psi;驻留时间(DwellTime):50ms;离子源温度(TEM):500℃;CXP(CollisionCellExitPotential):9V;EP(EntrancePotential):10V;38种农药的质谱检测条件见表1。2结果与讨论2.1质谱条件分析有机磷类农药组分的极性较大,易于离子化,适合ESI离子源。选择Q1全扫描,结果显示在正离子(ESI+)扫描模式下,所有化合物的响应值明显优于负离子(ESI-)扫描模式,具有较高的灵敏度。大多化合物都选择2个离子对,其中干扰少、响应高的离子对作为定量离子对,另外一个离子对作为辅助定性离子对。采用LC-MS/MS进行定性以及定量分析时,一些化合物的色谱峰可能会发生重叠,但通过选择目标物对应的特定离子对,便可单独分析其中一种物质,用多级反应监测分析共流物对单一组分分析干扰不明显。加标水平为1μg/g的空白烟样的选择离子谱图如图1所示。2.2流动相的影响流动相的组成是影响LC-MS/MS响应信号的重要因素。为选择适宜的流动相,实验在正离子扫描模式下考察了乙腈/水体系、甲醇/水体系以及加入0.1%甲酸-甲酸铵的甲醇/水体系。有文献报道对于农药残留分析,流动相中加入甲酸-甲酸铵有助于一些农药的正离子化。而本实验中加入甲酸-甲酸铵后的流动相没有增强各被检测化合物的离子化,并且使各组分的响应强度降低,峰型变宽;乙腈/水体系和甲醇/水体系的响应强度和出峰情况非常相似,由于本实验的前处理采用乙腈做提取溶剂,所以流动相选择了乙腈/水体系。2.3含水量低QuEChERS法最初是用于蔬菜和水果中农药残留检测的前处理,而烤过后的烟叶与蔬菜和水果的最大区别是含水量较低,烤烟的含水量在9.8%左右,而新鲜水果和蔬菜的含水量大都在70%-90%之间。所以在操作前,必须补足水分使含水量达到75%以上。比较在加入乙腈萃取前,不加水浸润和加水浸润两种情况,发现先加入10mL水浸润烟末,使烟末达到一定的含水量,更有利于农药的提取,38种农药的平均回收率都在正常范围内。2.4标准曲线的绘制和检测限为了减少基质效应带来的离子抑制或增强作用对定量分析产生的影响,采用空白样品提取液配制一系列基质标准工作溶液。分别称取38种农药的标准品各10.0mg于10mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容,摇匀得1000μg/mL的各标准储备液。取各标准储备液0.1mL于10mL容量瓶中,以甲醇定容得10μg/mL的混合标准储备液。选用空白烟叶试样按1.2的实验步骤提取后,得到空白样品提取液。用此空白基质,将38种农药的混合标准储备液分别稀释成浓度为0.001μg/mL、0.002μg/mL、0.005μg/mL、0.010μg/mL、0.020μg/mL、0.050μg/mL以及0.100μg/mL的标准工作液。按优化好的LC-MS/MS条件进行实验,采用外标法定量,即用各农药标样所对应的峰面积(y)对其相应浓度(x)进行线性回归分析,绘制标准曲线。线性关系和相关系数以及检测限见表2。结果表明,38种农药在1～100ng/mL范围内线性关系良好(R2≥0.9990),可以满足定量分析的需要。2.5回收率、精密度与定量限分别在2g空白烟叶样品中添加3个水平的38种农药的混合标准溶液,使其含量分别为0.25μg/g、0.5μg/g和1.0μg/g。室温放置1h后,按照1.2的前处理步骤进行回收率实验。每个添加浓度平行重复3次操作,测定精密度,结果见表3。由表3可以看出,38种农药在0.25-1μg/g添加浓度范围之间,加标回收率在60.15%-116.21%,相对标准偏差(RSD)在0.57%-19.25%之间。杀扑磷等个别农药的回收率在60%-70%之间,是因为不同的农药之间发生了化学作用或农药与烟叶组织键合,导致回收率降低。回收率虽低但恒定,也在农药多残留分析可接受的范围之内。因此该方法的准确度和精密度均符合农药多残留分析的要求。2.6农药含量测定测定了由FAPAS(FoodAnalysisPerformanceAssessmentScheme)所提供的4种烟样中的38种农药含量。结果表明,4种烟样中均含有多菌灵、苯线磷、苯线磷亚砜和丙溴磷4种农药,其平均含量分别为2.9μg/g、0.18μg/g、0.13μg/g和0.10μg/g。其余农药未检出。其中多菌灵的含量高于CORESTA(CooperationCentreforScientificResearchRelativetoTobacco,烟草科学研究合作中心)于2008年发