细胞培养的基本方法

细胞培养的根本方法编辑ppt细胞培养的根本概念2细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。编辑ppt细胞培养的目的与用途2一、根底研究(1)药物作用机理(2)基因功能(3)疾病发生机理二、科学研究:(1)新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等.(2)疫苗研究与开发:如肝炎疫苗,艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等.(3)基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发(4)单克隆抗体制备编辑ppt细胞培养主要的设施器材2设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。器材：一、玻璃器材玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，〔现已较少使用〕。

二、塑料器材多孔培养板〔6,12,24,48,96〕、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。三、橡皮器材橡皮制品〔最好是硅制品〕做各种瓶或试管的塞子、盖子。四、金属器材剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头五、其他物品纱布、注射器、针头、滤头编辑ppt细胞培养的条件〔1〕适宜的温度和PH37℃，pH7.2~7.4。〔2〕气体环境95%空气+5%CO2;适宜的湿度〔无菌水不能干掉〕。〔CO2：细胞生长所必需的成分,pH值维持，最低不能低于1%。〕〔3〕营养物质N源、C源、无机盐、维生素、H2O，细胞培养基中含有。常用的细胞培养基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199等。〔4〕无菌条件紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。编辑ppt设施、器材、试剂实物图编辑ppt培养细胞的分类按照是否贴壁：贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等。悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。按照传代次数：原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。〔也有人把传代10次之内的细胞统称为原代细胞。〕细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、CHO细胞等。编辑ppt原代培养原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶〔常用胰蛋白酶〕、螯合剂〔常用EDTA〕或机械方法处理，分散成单细胞，置适宜的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。编辑ppt原代消化培养法〔1〕处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；如疑心组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

〔2〕剪切：将组织切成2~3毫米大小的块，参加胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。〔3〕消化：置于37℃温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

〔4〕别离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速〔500~1000转/分〕离心收集细胞，弃上清。〔5〕参加适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。〔6〕培养：置于37℃，5%CO2温箱培养。编辑ppt原代组织块培养法〔1〕剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块外表血污，剪成1mm3小块。〔2〕摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。〔3〕轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右〔勿超过4小时〕，使小块微干涸。〔4〕培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。编辑ppt细胞的传代细胞传代的概念：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一那么细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物缺乏和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几局部，重新接种到另外的培养器皿〔瓶〕内，再进行培养，这个过程就称为传代〔passage〕。传代方法：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。编辑ppt细胞的传代悬浮细胞传代：〔1〕收集细胞悬液；〔2〕离心〔1000转/分，2分钟〕；〔3〕弃上清；〔4〕参加新鲜培养基重悬细胞；〔5〕按照适当比例接种到新的培养皿；〔6〕补足培养基；〔7〕放于温箱培养。重悬分装放入温箱编辑ppt细胞的传代贴壁细胞的传代：〔1〕吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞外表；〔2〕参加胰酶消化细胞；〔3〕参加新鲜培养基终止胰酶消化；〔4〕将细胞吹打下来，收集，离心；〔5〕弃上清；〔6〕参加新鲜培养基重悬细胞；〔7〕按照适当比例接种到新的培养皿；〔8〕补足培养基；〔9〕放于温箱培养。终止胰酶消化并吹打重悬分装放入温箱吸去旧培养基，PBS清洗加入胰酶消化编辑ppt细胞的换液悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、参加新鲜培养基重悬、补足培养基。或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液参加新瓶，补足新鲜培养基即可。贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、PBS清洗细胞外表、参加新鲜培养基。编辑ppt细胞的冻存悬浮细胞的冻存：〔1〕配制冻存液〔胎牛血清：二甲基亚砜9:1〕，每个冻存管需要冻存液1ml。〔2〕收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入-80℃冰箱，第二日转存于液氮中。编辑ppt细胞的冻存贴壁细胞的冻存：〔1〕配制冻存液。〔2〕弃去陈旧培养基，PBS清洗细胞外表，胰酶消化，终止消化，吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入-80℃冰箱，第二日转存于液氮中。吸去旧培养基，PBS清洗加入胰酶消化终止胰酶消化并吹打编辑ppt细胞冻存的本卷须知：〔1〕冻存液要最先配置。原因一：二甲基亚砜〔DMSO〕在参加血清时会产热损伤细胞。原因二：如果先用血清重悬细胞，再参加DMSO，那么局部DMSO浓度过高，会对细胞造成严重损伤〔DMSO在室温下对细胞有害〕，影响日后的复苏。〔2〕冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。〔3〕最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。〔4〕冻存时要缓慢降温〔慢冻〕，用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1℃，细胞冻存盒应先放在4℃预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻存盒，那么采用程序降温法。〔4℃冰箱40min，-20℃冰箱30-60min，置于-80℃过夜，次日转入液氮。〕编辑ppt细胞的复苏悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在于复苏后死细胞的去除方法。复苏流程：〔1〕取一支离心管，参加3ml的新鲜培养基备用。〔2〕取出冻存的细胞，于37℃的温水中，1min之内迅速融化。〔3〕迅速将解冻后的细胞参加预先准备好的离心管中，1000转/分钟，离心1分钟。〔4〕弃上清，参加新鲜培养基重悬细胞。〔5〕接种到培养皿〔瓶〕内，补足培养基，放入温箱培养。补足培养基放入温箱重悬3ml新鲜培养基备用1min之内解冻迅速倒入编辑ppt细胞的复苏复苏后死细胞的去除方法：悬浮细胞：细胞复苏后，每2天按照2:1或3:1的比例传代一次，大约1周后，细胞生长状态良好。贴壁细胞：细胞复苏后6h〔此时已有细胞贴壁〕，吸去培养基〔含有大量死细胞〕，重新参加新鲜培养基。编辑ppt细胞复苏的本卷须知〔1〕细胞复苏原那么：快速融化〔快融〕。〔2〕尽量减少室温下DMSO和细胞接触的时间。①预先准备好离心管并参加新鲜培养液；②在1分钟之内将细胞融化；③立刻将融化后的细胞倒入离心管中。〔3〕复苏时，离心时间不宜过长，1分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤，降低细胞存活率。〔4〕死亡的细胞应尽快去除掉，否那么会影响存活细胞的状态。〔5〕如果复苏不成功，更可能是因为冻存或保存过程中出现问题。编辑ppt细胞污染时的处理有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。假设污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下方法去除。〔1〕使用抗生素污染后去除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。〔2〕加温处理将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。假设先用药物处理后，再以41℃加温处理效果更佳。编