细胞传代培养实验

(细胞培养技术)实验方法原理(细胞培养技术)实验方法原理实验材料试剂、试剂盒仪器、耗材实验步骤培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。细胞D-Hanks液小牛血清RPMI1640双抗胰蛋白酶EDTANHCINaHC03净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管玻璃瓶培养瓶废液缸吸头枪头胶塞离心管量加样枪红血球计数板贴壁细胞的消化法传代：吸除或倒掉瓶内旧培养液。D-Hanks液洗2〜3次。向瓶内加入适量消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化(也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化)。消化最好在37°C或室温25°C以上环境下进行。消化2〜5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉。再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行。从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。实验材料试剂、试剂盒细胞实验材料试剂、试剂盒胰蛋白酶酒精PBS仪器、耗材计数，分别接种在新的培养瓶内。仪器、耗材超净工作台酒精传代精棉球培养箱显微镜吸管集细胞后心机或直接传代。离心传代法：实验步骤一、传代前准备实验步骤将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内。预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37°C水浴锅内预热。离心800~1000rpm,5min。用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液。正确摆放使用的器械，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。计数，分别接种在新的培养瓶内。点燃酒精灯，注意火焰不能太小。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。3.取分贴壁好的的传代液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7(1从培养箱内不出细胞，注意取出细胞时要旋紧消化盖处理酒精棉球擦拭显胞从的台脱落再在，镜而下观察细胞。8(2打开瓶大部分各生长一打开,，［同直接在酒精灯上烧伤较毒,。细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后才能吹打传代。收起稍彳微摇摇，然后从对侧倒掉培养液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精灯。二、胰蛋白酶消化注意事项胰蛋白酶要预温，温度37°C左右为宜。C。注意事项加入消化液：用PBS清洗(冲洗)，加入适量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好转速最佳消化温度是过低汇不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。'皿叉°显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明倒掉消化液加入培养液，弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液。注意要在对测加入培养液。三、吹打分散细胞吹打制悬：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心5分钟。弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。四、 分装稀释细胞分装：将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X105/ml，最后要做好标记。五、 传代培养用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。收起注意事项严格的无菌操作注意事项适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附：0.25%胰酶（胰蛋白酶，Trypsin）配方:100mlPBS,0.25g胰酶。步骤：先配100mlPBSo称胰酶0.25g。加入PBS中，低速搅拌。调pH7.4。过滤，分装，-20°C保存，4°C短期内用完。注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，