槟榔提取物清除过氧化氢自由基作用的研究

槟榔提取物清除过氧化氢自由基作用的研究

槟榔果实是棕榈树科植物的成熟种子。常用于中药。它是中国四大著名南药（槟榔、益、砂仁、巴戟）的第一位。槟榔含有槟榔碱、鞣质、多酚、槟榔油等多种生物活性成分,具有独特的保健、药用等功能,适当嚼食能预防和治疗某些疾病。目前国内外对槟榔提取物的活性评价主要集中在抗氧化、抗透明质酸酶、抗衰老、抗炎作用及抑制微生物生长等方面的研究,评价其抗氧化活性的方法主要有分光光度法、化学发光法、荧光光度法等,而伏安极谱法用于其活性评价的研究则尚未见报道。伏安极谱法是通过测定电解过程中所得到的极化电极的电流-电位曲线来确定溶液中被测物质浓度的一类电化学分析方法。由于具有测定灵敏度高、相对误差小、重现性好、无须分离、要求的试样量少、分析速度相对较快等优点,在环境、食品、制药、普通化学、电镀等领域有着广泛的应用。本试验采用微分脉冲伏安法及循环伏安法研究不同溶剂槟榔提取物清除过氧化氢自由基的活性,亦为该方法应用于其他天然植物提取物抗氧化活性的分析研究提供参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验材料1.1.2酸盐缓冲体系和仪器试剂:抗坏血酸(Vc)、咖啡酸(Caffericacid),均购自SIGMA;磷酸盐缓冲体系(pH7.0)、过氧化氢(H2O2)、乙醇、二甲亚砜(DMSO)等常规试剂均为分析纯,实验用水均为去离子水。仪器:797伏安极谱仪,瑞士万通公司产品;FZ-102植物粉碎机,上海胜启公司产品;R-210旋转蒸发器,瑞士Buchi公司产品。1.2方法1.2.1-dmso-g-6-基苯甲酰胺的制备槟榔鲜果清洗后切片,鼓风干燥后粉碎,过0.25～1mm筛备用。取10g粉碎的样品加入100mL溶剂(水、氯仿、正已烷、丙酮、乙酸乙酯),于常温浸提24h,重复3次后合并滤液,并于40℃、90mbar条件下挥去溶剂,然后用DMSO定溶于50mL容量瓶,置-4℃冰箱中保存备用。1.2.2极铂电极扫描测量条件:参照文献的方法,略有改动。测量模式为微分脉冲伏安法(DP),工作电极为悬汞电极模式(HMDE),参比电极为饱和甘汞电极,辅助电极为铂电极,汞滴大小为4,转速2000r/s,电压扫描范围-0.5～-1.5V,通氮5min,平衡时间5s,扫描速率15mV/s,脉冲振幅50mV。方法:于干燥洁净的电解池中,加入10mL(0.2mol/L)的pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)作底液按设定条件进行DP扫描,再加(1.2×10-4mol/L)30%的H2O2溶液进行DP扫描,对底液与H2O2进行稳定性试验,试验重复3次,取平均值。1.2.3辅助电极扫描测量条件参照文献的方法,略有改动。测量模式为循环伏安法(CV),工作电极为悬汞模式(HMDE),饱和甘汞电极为参比电极,铂电极作为辅助电极,汞滴大小为4,转速2000r/s,电压扫描范围-0.5～-1.7V,通氮5min,扫描速率1mV/s,脉冲振幅50mV。方法:于干燥洁净的电解池中,加入10mL的PBS进行空白扫描,再加5mL的H2O2溶液进行CV扫描,试验重复3次,取平均值。1.2.4清除能力方法:于干燥洁净的电解池中,按表1加入反应液,分别在不同时间对各反应液进行DP扫描,样品对H2O2的清除能力(scavengingactivity,SA)表示为:SA/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100(式中:A0为PBS、H2O2与溶于各样品溶液的峰电流,Ai为PBS、H2O2与样液的峰电流,Aj为PBS与各样液的峰电流)。试验重复3次,取平均值。1.2.5数据处理与统计分析实验数据用X±SD表示,采用SPSS统计软件进行方差分析和多重比较,采用LDS检验法进行差异显著性分析。2结果与分析2.1过氧化氢在不同浓度s12中的dp特性1.2×10-4mol/L30%的H2O2在电压范围-0.5～-1.5V扫描,在-0.9V处有最大峰电流出现,同时改变H2O2溶液的加入量,不同浓度H2O2的DP扫描曲线见图1,线性关系见图2。从图2可见,过氧化氢在一定浓度范围内,峰电流与浓度有良好的线性关系(y=-84.8045x+0.05;r=0.9909)。2.2不可逆性分析测定H2O2在底液中的性质,可得到双向的循环伏安曲线(图3)。从图3可见,在电压-1.2V处有一个电流峰值出现,H2O2属于强氧化剂,在电极上发生了还原反应,得到还原波,而反向扫描时没有出现阳极波,因此可以判断H2O2在电极中有且只有还原峰,而无氧化峰,具有不可逆性。2.3清除h2的能力Vc、咖啡酸与PBS底液混合液在-0.5～-1.5V范围内DP扫描均无明显的峰电流出现。Vc、咖啡酸与H2O2反应一定时间后的DP扫描曲线见图4、图5,Vc与咖啡酸对H2O2自由基清除速率见图6。从图6可见,Vc和咖啡酸均有清除H2O2的能力,且Vc清除H2O2的能力显著高于咖啡酸;在0.5～2h内Vc清除H2O2的速率快,2～5h清除速率缓慢,5h后达到稳定;咖啡酸0.5～4h内清除H2O2的速率较快,4～8h清除H2O2速率缓慢。PaulaC.A.G.Pinto等采用自动连续顺序注射分析系统结合荧光检测方法测定了Vc和咖啡酸清除H2O2的能力,其结果显示Vc清除H2O2的能力高于咖啡酸,与本研究的测定结果一致。这说明伏安极谱法可用作评价抗氧化剂清除H2O2活性大小的一种快速检测的分析方法。2.4各槟榔提取物清除能力的比较各槟榔提取物与PBS反应在-0.5～-1.5V范围内扫描均无明显的峰电流出现,H2O2与PBS及各槟榔提取物反应8h后,与Vc及咖啡酸的清除能力比较见图7。从图7可见,5种槟榔提取物均有一定的清除H2O2的能力;Vc清除H2O2的能力显著高于咖啡酸及各槟榔提取物的清除能力;而咖啡酸清除H2O2的能力明显高于丙酮提取物,而和其他溶剂提取物相比差异不显著。比较各槟榔提取物之间清除H2O2自由基的能力,其中乙酸乙酯提取物的最高,其数值明显高于氯仿和丙酮提取物;而水提取物清除H2O2的能力次之,氯仿、正己烷和丙酮提取物的清除能力略低。3其他有机溶剂提取的植物抗氧化活性的研究超氧自由基、羟基自由基是人体内氧代谢的重要活性氧产物,天然抗氧化剂对超氧自由基和羟自由基的清除作用是评价其抗氧化活性的重要指标。目前国内外已报道的评价抗氧化活性的方法主要有分光光度法、化学发光法、电子自旋共振法、荧光光度法、电化学法、脉冲辐射法等,但未见用电化学法检测清除H2O2自由基的能力。本试验结果表明,采用微分脉冲伏安法和循环伏安法检测各槟榔提取物均有清除H2O2自由基的能力;Vc的清除能力显著高于咖啡酸及各槟榔提取物的清除能力;比较各槟榔提取物之间清除H2O2自由基的能力,其中乙酸乙酯提取物的最高,水