基于am真菌孢子和透明压片法的植物与微生物互作关系研究

基于am真菌孢子和透明压片法的植物与微生物互作关系研究

塔里木盆地西北缘属于温带干旱干燥的沙漠气候，年降水量稀少，年平均降水量不到50mm。该地区大部分土壤特征是干燥多沙、良好的透水性、有机残留物和较多的养分。尤其处于绿洲荒漠地区的生态环境脆弱,部分植物群落衰败、土地沙漠化和盐碱化速度加快,已经成为整个塔里木盆地人工绿洲可持续发展的最大威胁。硬枝碱蓬(SuaedarigidaKungetG.L.Chu)作为西北干旱区中国特有种仅分布于塔里木盆地西北边缘的阿克苏-巴楚一线地区。严酷的自然环境条件使得硬枝碱蓬的分布范围很窄,呈间断分布。VA菌根真菌(Vesiculararbuscularmycorrhizalfungus)与植物根系形成的互惠共生体广泛分布于各类自然生态系统中,目前关于土壤理化性质对丛枝囊泡菌根(AM)真菌的影响及AM真菌提高植物耐盐碱性等的研究较多,但对塔里木盆地西北边缘这一特殊生态区,尤其是以硬枝碱蓬为建群种的适生区内植被菌根侵染状况及土壤理化性质对AM真菌影响的研究尚未见报道。笔者采用“湿筛倾析-蔗糖离心”和透明压片法等手段对以硬枝碱蓬为建群种地区主要伴生植物的菌根侵染状况及根际土壤AM真菌孢子数量与土壤因子之间的关系进行研究,以期进一步研究植物与微生物互作关系,为合理利用微生物资源和菌根技术促进以硬枝碱蓬为建群种适生区的植被恢复与生态改良提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面阿克苏-巴楚一线的建群种硬枝碱蓬根系、根系土壤及其伴生植物根系。1.2方法1.2.1样点采集和采集在阿克苏-巴楚一线选取以硬枝碱蓬为建群种的典型样方8个(每个样方面积为4m×6m=24m2),采样时间为2007年9月17～20日,每样点采集3～4个(包括1～2种主要伴生植物)根系和根围土壤样品。采集方法:先去掉表土2cm,取植物根系周围2～30cm深度的根际土壤1kg左右,并剪取植物的细根装入袋中密封,记录采样基本概况(表1)。1.2.2am真菌孢子混合物的测定将采集的土样采用“湿筛倾析-蔗糖离心法”筛选出AM真菌孢子混合物,置于培养皿的蒸馏水中,解剖镜下观测并记录孢子个数(个/100g土,一个孢子果按一个孢子计数)。1.2.3菌根感染率将采集4科15种伴生植物(每样点选取1～2种主要伴生植物)的根系从土壤中取出,仔细清洗干净后剪成1cm左右长的根段;用透明压片法制片,计算侵染率并划分侵染率等级。菌根侵染率(%)=有菌根侵染的根段长度检查根段总长度×100(%)=有菌根侵染的根段长度检查根段总长度×100侵染等级划分标准:菌根侵染率0～5%为1级;6%～25%为2级;26%～50%为3级;51%～75%为4级;76%～100%为5级。1.2.4测定方法的确定土壤pH值、有效磷、有效氮和总盐的测定分别采用电位法、NaHCO3浸提-钼锑抗比色法、丘林酸水解法和蒸干残渣法,参考《土壤农化分析》。1.2.4.酸度线的测量称20g土于烧杯中,加入100ml蒸馏水,振荡器振荡3min过滤,用酸度计测每个样品滤液的pH值,先预热酸度计30min,然后用标准试剂调节酸度计,接下来再测每个样品pH值。1.2.4.热压机温度用移液管吸取上述滤液20ml于有刻度的烧杯中(已称重),放入120℃恒温箱中过夜,第2天将烧杯移出放入105℃的恒温箱中6h后,冷却约30min后称重。盐分总量(g/100g)=称皿与残渣重−称皿重W×100(g/100g)=称皿与残渣重-称皿重W×100式中,W为待测液或样品土壤重,W=4g。1.2.4.硫酸鳌锑的光催化氧化(1)称取20g土250ml的三角瓶中,加入40ml浓度0.5mol/L的NaHCO3,再加一勺无磷活性炭,塞紧瓶塞,在振荡器上振荡30min,立即用无磷滤纸(绿色)过滤,滤液承接于150ml三角瓶中。(2)吸取10ml于50ml容量瓶中,加7.5g/L硫酸钼锑抗混合显示剂5ml,再利用其中多余的H2SO4来中和NaHCO3,充分摇匀(至无气泡时)排出CO2后加水定容至刻度,再充分摇匀(最后的H2SO4浓度为0.65g/L。)(3)30min后在光电比色计上用红色滤光板比色,或用72型分光光度计比色(波长660nm),比色时同时做空白测定(每次比色前将空白液回塞)。(4)计算。P(mg/100g)=Q×比色体积×分取倍数样品重×1000×100Ρ(mg/100g)=Q×比色体积×分取倍数样品重×1000×100式中,P指P含量,Q为从标准曲线上查得磷的mg/kg值;×1000指微克换算成毫克;×100指换算成每100g样品中P的毫克数。P(mg/100g)=(y+0.009/0.536)×1001.2.4.土壤中pahs的提取(1)称取土样2g和1gFe2(SO4)3粉剂,均匀铺在扩散皿外室内,水平地轻轻旋转扩散皿,使样品铺平。(2)在扩散皿内室中加2ml浓度2%硼酸溶液,并滴加1滴定N混合指示剂,然后在扩散皿外室边缘涂上特制胶水,盖上毛玻璃,并旋转数次,使毛玻璃与扩散皿边完全粘合,再慢慢转开毛玻璃的一边,使扩散皿露出一条狭缝,迅速加入10ml1.8g/LNaOH溶液于扩散皿的外室中,立即用毛玻璃盖严。(3)水平轻轻旋转扩散皿,使溶液与土壤充分混匀,用橡皮塞固定,随后放入40℃的烘箱中,24h后取出,再以0.01g/L盐酸标准液用半微量滴定管滴定内室硼酸中所吸收的氨量(由蓝色滴到微红色)。结果计算:N(mg/100g)=(N×V×14/样品重)×100=(0.02219×V×14/2)×1001.2.5数据收集采用SPSS11.5分析软件对测定数据进行分析。2结果与分析2.1微镜下观察通过解剖镜下观察AM真菌孢子,用微吸管吸取部分孢子制片,在Motic显微镜下观察可见放大的AM真菌孢子(图1A);通过透明染色,并在显微镜下观察制片,看到大部分伴生植物须根表皮上和皮层细胞中有红色的囊泡和丛枝结构存在(图1B和图1C),证明多数植物存在丛枝囊泡菌根真菌(即AM真菌)。2.2种主要伴生植物的确定由表2可知,被调查的硬枝碱蓬适生区的伴生植物主要为藜科,其次是禾本科、菊科和茄科,且多数种类属于极度旱生盐生植物,所调查的4科15种主要伴生植物中,86.67%受到AM菌根真菌侵染,通过比较AM菌根真菌对宿主植物的侵染率发现,不同宿主植物对AM菌根真菌的依赖性不同,AM菌根真菌对小獐毛、稗、黑果枸杞及花花柴侵染较高,均在50%以上,侵染等级在4～5级,说明这4种植物对AM菌根真菌的依赖性较大;而藜科中大部分植物的根系可形成菌根,但侵染率不高,在0～33.33%,侵染等级在1～3级,说明藜科植物对AM菌根真菌的依赖性较小。2.3数量的影响由表3可知,各样点的土壤pH值在8.23～8.75,均偏碱性且差别不大,故土壤pH值对各样点AM真菌孢子数量的影响不大;有效氮对各样点孢子数量的影响无一定规律。从表3和表4中可以清楚地看到,含磷量和总盐量与孢子密度的关系非常密切,而含氮量和pH值与孢子密度的关系没有那么密切。从上述分析可看出,试验范围内的有效磷(2.612～40.000mg/100g)和平均孢子数量关系符合幂方程:y=35.837x-0.627(R2=0.924,P<0.001),即土壤有效磷含量与土壤AM真菌孢子数量呈极显著负相关(图2),这与国内外许多学者的研究结果相一致。3土壤肥力对酵母菌根真菌生长的影响(1)由于塔里木盆地特殊的地理和气候条件,作为西北干旱区中国特有种的硬枝碱蓬受到自然和人为因素的影响,采样过程中发现,硬枝碱蓬的适生区基本处于绿洲荒漠过渡带,这些地区人为开荒现象比较严重,使人工绿洲不断扩大并替代了天然绿洲,但绿洲与沙漠之间的缓冲带缩小,又影响到沙漠边缘的植被。这些新开垦的绿洲大部分都会因为渠系不健全、排水不畅、土壤盐碱化逐步加重而最终撂荒。建群种为硬枝碱蓬的适生区土壤均为碱性土,其伴生植物也多属于盐生植物。该试验中86.67%的伴生植物受到VA菌根真菌不同程度的侵染,这一结果表明,建群种为硬枝碱蓬适生区内的伴生植物对菌根真菌具有较高的依赖性,不同伴生植物类型中菌根侵染率变化表现为:禾本科>茄科>菊科>藜科。(2)大多数研究表明,土壤肥力对丛枝菌根形成及繁殖体数量有直接影响。凡是土壤肥力较高时土壤中AM真菌孢子数量减少,而在肥力较低特别是N、P含量较少的条件下,AM真菌的孢子数量则较多。所有的营养元素中,磷与菌根形成的关系最为密切。土壤中磷含量过高往往抑制丛枝菌根真菌的发育和功能。该研究通过对土壤理化性质与孢子数量进行比