【浅析多肽化合物在细胞水平上对肿瘤细胞检验8500字（论文）】

实验数据与结果实验数据与结果多肽化合物在细胞水平上对肿瘤细胞的检验TOC\o"1-3"\h\u31011第1章绪论 155441.1选题背景与依据 1241761.2超分子自组装 117669第2章实验材料与方法 4150202.1实验材料与仪器 4227662.1.1实验试剂 4200172.1.2实验仪器 5218222.2实验步骤 6181202.2.1多肽化合物的Fmoc固相合成 6277832.2.2多肽分子的纯化 684192.2.3多肽分子自组装转化率的测定 753682.2.4多肽临界聚集浓度（CAC）的测定 7162372.2.5透射电子显微镜（TEM）观察多肽化合物的微观形貌 7157102.2.6细胞培养 8223502.2.7细胞传代 8274302.2.8肿瘤细胞碱性磷酸酶活性与EGFR受体的测定 8296542.3实验流程 94499第3章实验数据与结果 10173163.1多肽化合物的体外表征 10131891.多肽化合物的质谱结果 1066122.多肽化合物的转化率 10113893.临界聚集浓度（CAC） 10116314.多肽化合物的体外酶响应性研究 1189035.多肽化合物与EGFR受体的结合 12126493.2多肽化合物在细胞水平上对肿瘤细胞的检验 14296801.模式细胞的选择 14291272.基于TSCCA细胞的最优多肽选择 14138093.最优多肽对不同细胞的检测 1518067结论 1631419参考文献 17第1章绪论1.1选题背景与依据近些年来，癌症已成为仅次于心血管疾病导致死亡的第二大病因，给人类健康以及社会经济的发展带来了严重威胁。因此，探索开发更先进、更灵敏的肿瘤细胞检测技术是非常重要的，“早发现早治疗”，在治疗筛查中快速诊断肿瘤存在与明确肿瘤大小，从而尽早减轻肿瘤患者的痛苦，降低肿瘤造成的死亡率。我们知道，碱性磷酸酶（ALP）在生物体中是一种重要的酶，它可催化蛋白质、核酸以及一些小分子的去磷酸化反应；它也广泛存在于如肝肾、肠道等人体组织，同时研究发现在一些肿瘤细胞膜上ALP是高表达的，因此它被作为一种常见的触发剂来调控纳米材料在肿瘤细胞膜表面或胞内有选择性地形成。此外，在疾病细胞中也常常存在着一些过表达的抗体。如ErbB受体家族的上皮生长因子（EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR），是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。作为跨膜酪氨酸激酶，它们在细胞信号传导中发挥重要作用，影响细胞生长发育、分化、凋亡等重要过程。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR受体的高表达或异常表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。而我们也可利用这一特点，来设计一种能被肿瘤细胞上过表达的EGFR识别的多肽序列。在肿瘤微环境中，围绕肿瘤细胞的水凝胶化是一种选择性控制纳米药物原位自组装的策略，这促进了在肿瘤细胞周围形成药物富集，可被用于癌症治疗和诊断。本项目通过化合物的设计合成和表征得到带有荧光基团的酶促自组装多肽化合物，它可利用肿瘤细胞膜表面过表达的碱性磷酸酶（ALP）和表皮生长因子受体（EGFR），靶向地在细胞周围或者细胞膜上发生原位自组装；同时，我们设计不同磷酸化位点来控制对EGFR的靶向能力，以期能实现肿瘤细胞的高选择性检测。通过对荧光基团的测定，不仅可验证化合物在细胞水平上的自组装行为与分布情况，还可通过荧光强度的对比来检测肿瘤细胞，这为以后研究自组装分子在药物递送、生物监测等方向提供相关的理论基础。1.2超分子自组装超分子自组装是指在平衡条件下无序的单分子通过非共价相互作用（如氢键、疏水相互作用、静电吸引）自发地形成有序聚集体的过程，这是一种普遍存在于自然界的现象，并在生物功能和分子化学领域都起着关键作用，如DNA双螺旋结构、微管、囊泡、核酸转录机制等许多细胞亚显微结构和细胞机制，都可以看作是自组装在生物体中的微观表现。在最近的十年中，研究超分子自组装已逐渐成为一个热门的科学领域，人们尝试着利用自组装策略来构建具有特定功能的超分子纳米结构，这也给生物医学与材料领域开辟了新的发展方向。一般来说，超分子材料的性质与分子构件及其制备方法密切相关。多肽分子是由氨基酸通过酰胺键共价连接形成的，在生物体内具有多种生理功能，以此形成的多肽药物对正常细胞毒性较低，同时，它也可以形成特定的二级、三级和四级结构，而多肽分子的不同二级结构会影响分子的自组装行为，从而进一步影响纳米材料的结构和功能，这是一般的化学药物所不具备的，也为纳米材料的结构设计提供了独特的研究方向。但是，一般情况下，传统的多肽药物具有低稳定性，容易在体内生理条件下被酶降解，即半衰期较短，需持续给药以维持有效的药性，这大大阻碍了它们进一步转化为药物或诊断工具。针对这些不足，许多研究者通过多肽修饰、改变给药途径等方式来有效延长其半衰期。已有研究发现，当多肽片段组装成超分子材料时，其降解效率降低；更重要的是，由于其多价性，具有高亲和性，使得它们的生物活性与协调性会有所提高。此外，随着多肽固相合成技术的进步，我们可以更容易地在温和的反应条件下获得具备特定氨基酸序列的多肽，且在后续实验中多肽容易被分离纯化，产率较高。而随着对多肽序列和空间结构的理解，我们可以通过合理的序列设计、控制多肽的二级结构或其分级自组装过程，合成具有独特性质与功能的非天然多肽分子以满足不同的研究需求。通常情况下，溶液中的多肽分子可以形成特定的二级结构，在适当地刺激（如改变温度、调节pH、加入金属离子、酶转化等化学或物理的手段）下自组装形成纳米纤维，在三维空间中逐渐形成较厚较长的纤维，从而形成纳米纤维网络；而水分子可以被困在这些三维的纤维网络中，从而形成水凝胶。水凝胶是超分子自组装材料的一种，其具有的空间网状结构能实现良好的支撑性能，以及互补的孔道结构使得其渗透性良好，因此超分子水凝胶在药物控释、组织工程、生物成像等不同领域都展现出了较大的潜在应用价值。在各种形成超分子结构方法中，酶促自组装策略是一种强有力的促发体内原位自组装的手段。在自然界中，高效专一的酶可催化多种化学反应，参与调节细胞机制与维持各种生物活动；通过对氨基酸的修饰与多肽序列的设计，可得到积极响应酶的多肽分子，它能更加深入地参与到各类生理机制中。有研究表明，与一般的加热——冷却的自组装方法相比，酶促自组装可促使药物自组装成具有α螺旋结构的聚合体，从而更容易穿过细胞膜，这种现象使得纳米药物相对于游离的以及非酶促自组装体系的药物分子具有更强的生物活性与靶向性，也展示出酶促自组装策略在辅助多肽折叠和形成药效最佳的纳米药物方面具有独特的优势，能在生物环境中以更精确和更可控的方式来原位构建超分子纳米聚合物。在这近十年里，酶促自组装策略的研究取得了相当大的进步，在生物医学组织工程，药物传递系统和离子通道的调节等方面有广阔的应用前景。各种酶促反应被陆续探索，以期指导多肽或其类似物的自组装，形成不同的纳米聚合物，以此实现不同的功能，满足人们的不同需求，尤其是肿瘤治疗与检测方面受到了人们的广泛关注。大多数情况下，一些疾病细胞会过表达或高表达某些酶或抗体，因此可利用过表达的酶来控制分子的非共价键自组装：将药物或荧光分子与多肽结合为前体，通过自组装的位点选择性激活，进而形成一定特殊结构的药物载体；这可以在较大程度上提高了药物的靶向性与富集率。第2章实验材料与方法2.1实验材料与仪器2.1.1实验试剂表1常用实验试剂试剂来源Fmoc－氨基酸上海吉尔生化甲醇（色谱纯）（MEOH）天津康科德科技有限公司二氯树脂天津南开和成有限公司4－氯－7－硝基苯并－2－氧杂－1，3二唑（NBD-CI）百灵威科技有限公司苯并三氮唑－N,N,N',N'－四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）上海毕得医药有限公司NN－二异丙基乙胺（DIEA）上海Adamas有限公司三氟乙酸（TFA）百灵威科技有限公司无水乙醚天津市化学试剂有限公司三异丙基硅烷（TIS）上海毕得医药NN－二甲基甲酰胺（DMF）天津市化学试剂有限公司二氯甲烷（DCM）天津市化学试剂有限公司二甲基亚砜（DMSO）天津市化学试剂有限公司四氢味喃（THF）天津市化学试剂有限公司盐酸天津市化学试剂有限公司无水硫酸钠（Na2SO4）天津市化学试剂有限公司三乙胺（TEA）天津市化学试剂有限公司碱性磷酸酶日本Takara株式会社DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）美国Gibco公司青链霉素混合液（双抗，PS，100×）Hyclone公司美洲胎牛血清（FBS）HumanEGFRProtein（His-tag）HumanEGFProtein碱性磷酸酶试剂盒（P0321）以色列BI北京义翘神州科技股份有限公司北京义翘神州科技股份有限公司上海碧云天生物技术有限公司2.1.2实验仪器表2主要实验仪器仪器来源电子天平德国arturious，BS124S超声清洗仪昆山市超声有限公司，KQ3200E循环水式多用真空泵郑州长城科工贸，SHB-II旋转蒸发仪瑞士BUCHI，R-100高效半制备液相色谱仪北京创新通恒LC3000高效液相色谱质谱联用仪日本岛津，LC-MS2020液相高分辨质谱联用仪Agilent6520Q-TOFLC-MS冷冻干燥机北京亚泰科隆，LGJ-1-50透射电子显微镜HITACHIHT7700Exalens多功能酶标仪美国BioTek，Synergy4纯水机密理博Mili-QAdvantageA10全数字核磁共振仪德国Bruker，Bruker400M流式细胞仪BDFACSCalibur2.2实验步骤2.2.1多肽化合物的Fmoc固相合成多肽的合成是一个重复添加单个氨基酸的循环过程。本实验采用二氯树脂（取代度为1.1mmol/g）作为不溶性的固相载体对多肽分子进行标准的固相合成（solidphasepeptidesynthesis，SPPS），以封闭基团Fmoc作为侧链保护的氨基酸的羧基被活化剂HBTU活化，而活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键，最终从C端向N端逐个的合成所设计的多肽链；同样，封端基团NBD也可通过缩合剂与氨基酸实现共价链接。具体合成步骤如下所示：称取相应量的二氯树脂加至反应固相管中，加入DCM溶剂溶胀，置于脱色摇床上，10min~15min后除去DCM。将异亮氨酸Fmoc-Ile-OH（353.4g/mol）与DIEA以1：2的比例溶于DCM后，一起加到固相管中，反应1h。加入20mL的封闭液（DCM：MEOH：DIEA=17：2：1）封闭多余位点10min-15min。用DCM洗3~5次，DMF洗5次，以此置换反应溶液，每次1min即可。加入约20mL的20%哌啶溶液（哌啶：DMF=1:4）切割30min氨基酸的Fmoc封端基团。切割完成后用DMF洗5次。以氨基酸：HBTU：DIEA=1：1：2的比例称取下一个缬氨酸Fmoc-Val-OH（339.40g/mol），并溶于DMF至固相管中，反应2h。DMF洗3~5次，再加入20%哌啶溶液，反应30min后除去哌啶，DMF洗5次。以后加入的氨基酸均重复此步骤，并注意加入一些特别的氨基酸（如磷酸化的酪氨酸）后可增加反应时间。最后加入封端化合物NBD反应2h，DMF洗3~5次，再用DCM洗3~5次，实现溶液置换。将切割剂加入到固相管中反应50min，使多肽从树脂上切割下来。用DCM溶液洗6次，并收集溶液至干净的茄型瓶。用旋转蒸发仪蒸干，向蒸干的物质中加入适量无水乙醚，静置12h使固体析出，除去大部分的上层溶液，用洗耳球吹干乙醚，再用真空泵抽干剩余乙醚，收集固体于离心管中，并称量粗产品。2.2.2多肽分子的纯化本实验采用反相高效液相色谱（HPLC）纯化分离粗产品，纯化柱的填料为粒径5μm的C18填料，流动相A为95%水+5%甲醇+0.05%TFA，流动相B为99.95%甲醇+0.05%TFA，流速8mL/min，柱温50℃。制备分离样品：称量一定质量的多肽粗产品，置于干净的离心管中，用塑料滴管吸取适量DMSO加入使其溶解，注意应计算好溶液浓度。若在溶解过程中有不溶物，可进行超声；随后用孔径0.45μm的有机滤膜过滤以此除去杂质。进样分离：将溶液从进样口打入，注意保证每次每针进样量都应小于10mg，且进样溶液体积为150μL~300μL以避免溶液密度过大而导致纯化柱堵塞。而根据多肽化合物的亲疏水性差异，确定洗脱梯度。随后待目标产物出峰的时间内用15mL的干净离心管收集溶液，使用液质联用仪确定是否为所合成的多肽产物。收集产物：将收集好的溶液用旋转蒸发仪旋去溶液中多余的甲醇溶剂，加入少量水与2滴盐酸溶液（2mol/L），置于－80℃冰箱过夜，最后采用冷冻干燥装置，进行干燥处理，收集固体产物，置于－20℃的冰箱内保存。2.2.3多肽分子自组装转化率的测定将一定质量的多肽化合物Comp.1、2、3、4溶于磷酸盐缓冲溶液PBS（pH=7.4）中，并将Na2CO3（1mol/L）加入到上述溶液中，超声混匀，调节pH值使其最终为7.4，再加入PBS溶液使其总体积达1mL；将体系置于37℃环境中稳定10min。随后加入10U/mL的碱性磷酸酶（ALP），再置于37℃下反应30min以期触发自组装。随后，在一定的时间点取50μL样品加入到150μL甲醇中，用LC-MS检测。2.2.4多肽临界聚集浓度（CAC）的测定多肽化合物的临界聚集浓度（criticalaggregationconcentration，CAC）是由不同浓度梯度下样品溶液的动态光散射（dynamiclightScattering，DLS）数值决定。配置化合物母液，用Na2CO3（1mol/L）溶液调节pH为7.4，用滤过的PBS将母液稀释成系列浓度的样品，分别取100μL进行检测。整个样品制备的过程在无尘条件下进行，所用的玻璃小瓶和1.5mL的离心管等容器均需用丙酮浴除尘，所用的溶剂PBS用0.22μm的无菌滤膜过滤。本实验利用激光扫描分光仪在动态光散射模式下测的不同浓度下样品的光强值，通过origin软件拟合出每个样品的临界胶束浓度。2.2.5透射电子显微镜（TEM）观察多肽化合物的微观形貌本过程以实验步骤4所得的去磷酸化前后的溶液作为检测样品，用移液枪吸取并滴加在覆盖有支持膜的电镀铜网中心上，待其吸附后，用滤纸从边缘小心吸走多余的样品；依次滴加去离子水与醋酸轴的饱和溶液，并依次用滤纸把溶液尽量地吸干；将制备好的铜网置于已做好标记的圆形滤纸上，并放在干燥器中干燥一段时间，送至透射电镜观察化合物去磷酸化前后的微观形貌。2.2.6细胞培养将冻存于液氮罐的不同肿瘤细胞系取出，先置于37℃的水浴锅内解冻细胞，将解冻的冻存管喷75%乙醇消毒后，转移到已用紫外灯照射灭菌30min的超净台中，进行后续操作。将细胞转移到15mL无菌的离心管中，并加入3mL细胞培养基；随后置于离心机中室温下以1000r/min离心3min，使细胞沉淀于底层，用移液枪吸取上清，加入1mL新的培养基，用移液器轻轻吹打培养基使细胞悬浮，并转移到已有9mL的培养皿中，最后置于37℃细胞培养箱中培养。每天在倒置生物显微镜下观察细胞生长状态，待其贴壁张满培养皿的80-90%时，可将其进行传代培养，以此避免细胞密度较大而造成细胞死亡。2.2.7细胞传代用移液枪吸走培养基，加入1mL胰蛋白酶后，置于37℃培养箱中消化3min~5min，具体可由细胞情况来决定消化时间。加入2mL新鲜培养基以终止胰酶消化，倾斜培养皿并用移液枪吹打细胞使其均匀，将悬浮液转移到15mL离心管中，室温下1000r/min离心3分钟。取出离心管，用移液枪吸去上清液，用适量的培养基重悬沉淀的细胞，并将悬浮好的细胞均分到含有9mL培养基的培养皿中继续放到37℃细胞培养箱中培养。若要进行细胞冻存，则重复上述步骤，弃去上清，加入细胞冻存液，并将其转移到细胞冻存管中，再放到恢复至室温的程序降温冻存盒中，最后放入－80℃冰箱中，维持时间大于4h，才可将细胞转移到液氮罐中进行长期存储。2.2.8肿瘤细胞碱性磷酸酶活性与EGFR受体的测定本课题通过商用抗体对几种不同细胞的ALP在胞外的表达以及EGFR的表达量进行检测，采用上海碧云天公司的试剂盒（P0321）来检测胞外碱性磷酸酶，具体操作根据说明书进行即可。对于流式细胞术测定细胞EGFR受体的平均荧光强度，先将细胞以1x105个的密度接种到6孔板中培养24h，除去孔板中多余的培养基，用PBS洗3次，加入溶于PBS溶液的EGFR抗体于冰上孵育30min；用PBS洗3次后，收集孔板中的细胞，送至流式细胞仪检测。2.3实验流程第3章实验数据与结果3.1多肽化合物的体外表征1.多肽化合物的质谱结果Comp.1：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.63；Comp.2：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.83；Comp.3：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.94；Comp.4：MALDI-TOF:calcM+=2125.9152，obsvd(M+H)+=2127.75。结果表明，我们成功制备合成了所设计的化合物Comp.1、Comp.2、Comp.3，Comp.4，2.多肽化合物的转化率我们通过LC-MS测得在不同时间点，去磷酸化后的三种多肽化合物的转化率。从图2中可以看出多肽Comp.1在4h转化90%左右；Comp.2在1h中后可快速转化60%，之后转化速率降低，在4h后也只能转化74%左右；Comp.3相对其他两组转化得更加缓慢，4h只能转化55%左右。我们猜想这应该是由于不同磷酸化位点，而引起的转化率不同。图2多肽化合物的转化率3.临界聚集浓度（CAC）为判断不同化合物的组装能力，采用动态光散射（DLS）分别测定了多肽化合物Comp.1、2、3和4的临界聚集浓度。如图3所示，我们可以得出Comp.1的CAC值最低，在85.7uM左右；CAC值约为89.6μM的Comp.2次之，Comp.3的CAC值约为105.4μM，这可能是由于磷酸化位点的不同而导致临界聚集浓度的差异。与之相比，不带磷酸化的多肽Comp.4的CAC值则更加的高，约为130.7μM。由此可见，Comp.1具有最出色的组装能力。图3多肽化合物的CAC图表4.多肽化合物的体外酶响应性研究我们通过透射电子显微镜观察加入碱性磷酸酶（ALP）前后，三种多肽化合物的微观形貌变化，这有助于更好地发现和说明宏观变化的内在因素。图4显示，Comp.1与Comp.2的PBS溶液中存在直径6nm~7nm的较为粗短的纳米原纤维结构，而Comp.3的PBS溶液中纳米纤维分布较为疏松。此后，我们将ALP添加到Comp.1、2、3的PBS溶液中37℃孵育，电镜结果显示它们分别形成50nm~70nm左右的纳米纤维，分布致密且有较多的交联节点。图4ALP催化前后的多肽化合物的微观形貌5.多肽化合物与EGFR受体的结合如图5所示，多肽Comp.1在转化之前的与EGFR生长因子的结合常数为51.44μM,而其他带有不同磷酸化位点的多肽化合物分别为3.11μM、7.52μM，Comp.1约为它们的17倍、7倍，与EGF蛋白结合常数（459.89nM）相比差距较大。由图6可得，当加入ALP之后，实现多肽上酪氨酸的去磷酸化，Comp.1组为738μM，明显低于未加ALP的组别，也展现出了与EGF蛋白相似的结合常数。酶促自组装策略可以提高－YHWYGYTPQNVI－与EGFR受体的结合选择性，同时也说明只有在正确的位点才能提高EGFR结合的选择性。图5多肽化合物、EGF蛋白与EGFR受体的结合常数图6去磷酸化的多肽与EGFR受体的结合常数3.2多肽化合物在细胞水平上对肿瘤细胞的检验1.模式细胞的选择本课题通过商用抗体对几种不同细胞系的胞外碱性磷酸酶ALP与EGFR受体的丰度进行检测，以此筛选并确定最终的模型细胞即最高表达量ALP与EGFR的肿瘤细胞。如图7（a）所示，随着时间变化，ALP与底物相应的吸收值增加；同时，在时间点上的斜率越大，说明ALP的相对含量也越大。SCC15、UMI、TSCCA和CAL-27肿瘤细胞的胞外ALP酶含量较高且这四种细胞系ALP含量差异较小，这几种头颈部肿瘤细胞的胞外ALP的含量均高于HUVEC人脐静脉内皮细胞。在图7（b）中，左侧是平均荧光强度，右侧是阳性细胞比例（即抗体标记的细胞占总细胞数量的比例）；可以看出TSCCA的EGFR丰度最大，其次是HN4。(a)(b)(a)(b)Cells图7(a)不同细胞外ALP与显色底物作用的吸收值；(b)不同细胞中针对EGFR受体的平均荧光强度（左）与阳性细胞比例（右）2.基于TSCCA细胞的最优多肽选择本课题用不同多肽序列Comp.1、2、3、4与该肿瘤细胞进行培养，并检测哪一种序列能在细胞周围有效形成纳米纤维，以此确定最优多肽序列。通过共聚焦显微镜的直观观察，与其他化合物相比，多肽Comp.1荧光强度最高，在TSCCA肿瘤细胞周围聚集，由此推测，不同的磷酸化位点能影响多肽化合物对肿瘤细胞的选择性，而其中Comp.1的多肽序列能更好地在肿瘤细胞实现酶促自组装而形成纳米纤维，因此确定Comp.1作为本课题的最优多肽。参考文献致谢图8不同多肽化合物培养TSCCA细胞的共聚焦成像3.最优多肽对不同细胞的检测将多肽化合物Comp.1与多种细胞进行培养后，通过流式细胞术验证该多肽化合物对不同的肿瘤细胞或正常细胞的选择性，如图9所示，这些细胞所得的MFI很明显高于空白对照，即说明该策略中对不同细胞的EGFR检测的普适性；而其中TSCCA细胞的平均荧光强度最高，也验证了Comp.1对TSCCA细胞的高选择性。图9多肽Comp.1培养的不同细胞的平均荧光强度与空白对照结论本课题根据人舌鳞癌细胞TSCCA的细胞膜外过表达碱性磷酸酶（ALP）以及细胞膜上过表达的受体EGFR的特点，将响应ALP的磷酸化酪氨酸（pY）与响应EGFR的多肽序列-YHWYGYTPQNVI-相结合，最终设计与合成能实现酶促自组装的多肽化合物。这种多肽化合物Comp.1可响应细胞外的碱性磷酸酶而发生自组装行为，形成直径约为60nm~70nm的纳米纤维，且与EGFR膜受体结合性良好。在细胞水平上，首先，我们根据EGFR以及胞外ALP的表达量，确定模型细胞TSCCA。由于多肽的封端NBD的荧光性，观察到该化合物能在细胞周围或细胞膜表面进行原位自组装形成纳米纤维，从而确定多肽Comp.1具有良好的胞外富集度，验证了其自组装行为以及在细胞周围的分布情况。另一方面，再将多肽Comp.1与多种细胞进行培养后，通过流式细胞术验证了该多肽化合物对不同的肿瘤细胞或正常细胞的选择性。酶促自组装策略构建了一种能够靶向肿瘤细胞的纳米材料，并能通过荧光分子实现肿瘤细胞的高选择性检测，可为个性化医疗提供相应的理论支持。本课题结合多肽合成、纳米材料、细胞工程等学科领域，体现出交叉学科的特点，拓宽了基于多肽自组装材料的应用范围，为制备新型纳米药物递送体系开发了新的策略与研究方向。尽管有许多开创性工作已证明了酶促自组装策略在制备超分子纳米材料中的重要性，但仍然面临各种挑战。为了实现酶促自组装原位形成纳米材料，大多数工作都是在肿瘤细胞上进行的，因此在后续实验中，还可通过识别在其他疾病部位表达水平升高的酶来进行自组装，开发出对这类疾病的诊断或治疗方法。同时，大多数报道的例子都用一种酶来证明，而由两种酶构建或控制的超分子纳米材料可能对目标细胞和器官显示出更高的选择性，这也要求我们对酶催化多肽折叠和自组装的机理的理解更深。另一方面，还存在着许多其他诱导多肽自组装的方法，若将它们与酶促自组装策略结合，可能会以更可控的方式形成纳米材料。而迄今为止，大多数工作都是在体外进行的，因此，酶促自组装策略的体内应用也待研究。参考文献WhitesidesGM,GrzybowskiB.Self-assemblyatallscales[J].Science.2002;2952418-2421.David,E,Clark,etal.Self-Healing,Self-Assembledβ-SheetPeptide–Poly(γ-glutamicacid)HybridHydrogels[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2017,139(21):7250-7255.

YuanG,YangZ,YiK,etal.Enzyme-instructedself-assemblyofpeptidederivativestoformnanofibersandhydrogels[J].Biopolymers,2010,94(1):19-31.YuZ,XuQ,DongC,etal.Self-AssemblingPeptideNanofibrousHydrogelasaVersatileDrugDeliveryPlatform[J].CurrentPharmaceuticalDesign,2015,21(29):-.张伟,宋竟婧,张邦治,等.多肽新药研发策略研究进展[J].中国科学:化学,2013,43(08):941-952.王克全,徐寒梅.多肽类药物的研究进展[J].药学进展,2015,39(09):642-650.OngZY,WiradharmaN,YangYY.Strategiesemployedinthedesignandoptimizationofsyntheticantimicrobialpeptideamphiphileswithenhancedtherapeuticpotentials[J].AdvDrugDelivRev,2014,78:28-45.Gao

J,Zhan

J,Yang

Z.Enzyme-InstructedSelf-Assembly(EISA)andHydrogelationofPeptides[J].AdvancedMaterials,2019.PochanDJ,SchneiderJP,KretsingerJ,etal.Thermallyreversiblehydrogelsviaintramolecularfoldingandconsequentself-assemblyofadenovodesignedpeptide[J].J.am.chem.soc,2003,125(39):11802-11803.Xing,R.R.,Yuan,C.Q.,Li,S.K.,etal.Charge-InducedSecondaryStructureTransformationofAmyloid-DerivedDipeptideAssembliesfrombeta-Sheettoalpha-Helix[J].AngewandteChemie-InternationalEdition,2018,57(6)ZouR,QiW,WuJ,etal.Peptideself-assemblytriggeredbym