突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建

突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基

因融合载体的构建作者：张丽娟王凤斌成敏刘蓉【摘要】目的构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合载体。方法在NCBI上查找APP695的序列，设计引物。以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板，以突变体引物扩增突变型APP695。将突变型APP695与pIRES2EGFP连接并测序证实。结果经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法，证实构建的pIRES2EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。结论成功构建APP695 EGFP融合基因载体，为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物筛选奠定基础。【关键词】瑞典突变APP695；增强型绿色荧光蛋白；APP695EGFP融合基因；载体【Abstract】 ObjectiveToconstructandexpressarecombinantvectorbearingfusiongeneofhumanamyloidprecursorprotein(APP)695mutantgeneandenhancedfluorescenceprotein(EGFP)fusiongene.MethodsTheprimersweredesignedaccordingtothesequencesofAPP695genefoundfromNCBI.ThenthemutantAPP695wasamplifedbyPCRwithpCB6carryingwildhumanAPP695andactingasatemplate,thegeneofmutantAPP695wasligatedtopIRES2EGFP.TherecombinantplasmidofpIRES2EGFP/APP695mutantwasverfiedbycheckingsequences.ResultsTheexactsequencesofpIRES2EGFP/APP695mutantvectorwereconfirmedbydigestionofrestrictionendonucleases,PCRandsequencing.ConclusionsThepIRES2EGFPAPP695mutantfusiongenerecombinationhasbeenconstructedsuccessfully,whichlaysthefoundationforfurtherresearchofADpathogenesisandscreeningnewdrugtargetsonADtherapy.【Keywords]SwedishmutantAPP695；EGFP；FusiongeneofhumanAPP695/EGFP;Vector淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)基因是Alzheimer病(AD)已发现的诸多相关基因之一。APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性AD,故APP的突变在AD发病中的作用引起了广泛关注。本研究应用增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)作为报告基因，将APP695突变基因与其融合，构建突变型APP695 EGFP融合基因载体，为进一步研究APP695突变在AD发病中的作用，以及筛选对AD有治疗作用的药物奠定基础。1材料与方法1.1材料携带野生型人类APP695的pCB6质粒，由美国加利福尼亚大学细胞分子医学院许华熙博士惠赠。携带EGFP的pIRES2质粒载体，由潍坊医学院免疫学教研室保存,DH5a感受态细胞为潍坊医学院免疫学实验室冻存。NheI、Hindlll、SmaI、XbaI等限制性内切酶，T4DNA连接酶与TaqDNA聚合酶，引物等均购自上海生工生物工程技术服务公司。1.2方法1.2.1pIRES2EGFP APP695融合基因重组质粒的构建将携带EGFP的pIRES2质粒载体用NheI、Hindlll酶切后，采用PCR扩增突变型APP基因，用Premier5软件设计PCR引物，以pCB6 APP695野生型质粒载体DNA作为模板，PCR扩增突变APP基因。引物序列为：TA1APPU:5'attgctagcatgctgcccggtttggc