微生物工程菌种与种子扩大培养课件

第一章：菌种与种子扩大培养

微生物工业用菌种

种子扩大培养

影响种子质量的主要因素第一章：菌种与种子扩大培养第一节微生物工业用菌种一、微生物的特性

有些微生物能在厌氧的条件下生长

有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长

有些微生物能进行复杂的代谢

有些微生物能利用较复杂的化合物

有些微生物能在极端的环境下生长第一节微生物工业用菌种有些微生物能在厌氧的条件下生长有二、工业化菌种的要求

能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物

有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强

遗传性能要相对稳定

不易感染它种微生物或噬菌体

产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）

生产特性要符合工艺要求二、工业化菌种的要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源1、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：三、已工业化产品生产菌的介绍放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些2、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：2、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，谷氨酸发酵的菌种：其它3、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌3、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研四、菌种分离与保藏1、菌种分离的一般过程土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：四、菌种分离与保藏1、菌种分离的一般过程土样的采取→预处理2、采样时要注意的问题

气候、水分、空气

来源要广

结合产品的特点

标签：地点、时间、气候等2、采样时要注意的问题气候、水分、空气来源要广结合产品富集的三种方案：

定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。3、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑，

不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法富集的三种方案：定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31）但主要是通过培养的方法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31）定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温4、菌落的选出

从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）

从形态的角度

菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。4、菌落的选出从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）→80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型↓实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸例：醛肟水解酶的筛选

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培养基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落例：醛肟水解酶的筛选--Journalofbiotech5、目的微生物富集方法的研究进展

分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等

目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。

2002,陈文新（科学院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～815、目的微生物富集方法的研究进展分子生物学的实验手段，在微六、菌株选育与分子改造目的

提高生产能力

提高产品质量

开发新产品

解决生产实际问题

防止菌种退化六、菌株选育与分子改造目的提高生产能力提高产品质量方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNAShuffling等方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。1、自然选育自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。2、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍{2、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选（2）、诱变剂处理过程中几个有关的问题

化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择（1）、诱变剂的作用原理（略）压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH（2）、诱变剂处理过程中几个有关的问题化学诱变剂使用过程的（3）、诱变育种的一般步骤(p83)（4）、筛选的方法

随机筛选

形态

理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。（3）、诱变育种的一般步骤(p83)（4）、筛选的方法随HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型：如Thr缺陷型HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制HT:黄色短杆菌F9-50的诱变谱系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l黄色短杆菌F9-50的诱变谱系Bervibacter3、基因的直接进化(directedevolution)

突变基因突变库的建立筛选基因突变库的筛选基因复制与遗传步骤：

在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。3、基因的直接进化(directedevolution)七、生产用菌种的保藏与复壮（一）、菌种保藏1、概念：根据菌种的生理生化特点，人工地创造条件，使其代谢活动处于不活泼状态。2、不同情况、不同菌种采用不同方法。斜面低温保藏法（如酵母菌）石蜡油封保藏法（如酵母菌）砂土保藏法（如放线菌）硅胶保藏法冷冻干燥保藏法（如一般细菌）液氮超低温冻结法（如真菌）七、生产用菌种的保藏与复壮（二）、防止菌种衰退的措施（1）、菌种的衰退发酵力的下降繁殖力的下降发酵产品的得率降低（2）、衰退的原因菌种保藏不妥菌种生长的要求没有得到满足

遇到不利的条件失去某些必要的条件发生回复突变

（二）、防止菌种衰退的措施（3）、防止衰退的方法做好菌种的保藏工作尽可能满足生长条件尽量减少传代次数（4）、菌种的分离复壮普通方法：稀释平板法或平板划线法分离单细胞菌落芽孢杆菌：先将菌液沸水处理数分钟，再用平板进行分离改变培养条件：如单细胞分离仍效果不佳，可考虑改变培养温度条件，以利高产菌株生长而不利低产菌株生长返回（3）、防止衰退的方法第二节种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求工业微生物的培养类型种子制备的技术概要及种子制备实例影响种子质量的因素第二节种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求工业微生物的培

种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。一、种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念:种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中种子扩培的目的

接种量的需要

菌种的驯化

缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：

总量及浓度能满足要求

生理状况稳定，个体与群体

活力强，移种至发酵后，能够迅速生长

无杂菌污染种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间二、工业微生物的培养类型培养类型静置培养通气培养种子扩大培养液体培养表层培养固态培养大规模工业生产嫌气性发酵好气性发酵酒精、丙酮、丁醇、乳酸等固体培养液体深层培养载体培养两步法液体深层培养返回二、工业微生物的培养类型培养类型静置培养通气培养种子扩大培养三、影响种子质量的因素（一）、种子制备的过程三、影响种子质量的因素（一）、种子制备的过程（一）、种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。（一）、种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培（二）、实验室阶段1、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：

对于不产孢子和芽胞的微生物

——获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。（二）、实验室阶段1、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的

获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。

对于产孢子的微生物

获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得2、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。2、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢3、起始接种物的传代问题

细菌保藏斜面→活化斜面

产孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌种的传代次数尽可能的少。3、起始接种物的传代问题细菌保藏斜面→活化斜面

母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。

子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落②接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月。孢子培养不产孢子的细菌如谷氨酸棒杆菌和短杆菌，采用斜面营养细胞保藏法，2~3月移种1次产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种如灰色链霉菌和卡那霉菌，可将孢子接入液体培养基中形成菌丝体种子。母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。子（三）、生产车间阶段1、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。

缩短发酵时间

有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：（三）、生产车间阶段1、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终2、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:

一是成本二是驯化2、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养例：柠檬酸发酵

以蔗糖为原料成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%琼脂2%例：柠檬酸发酵以蔗糖为原料成分

薯干粉成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%琼脂2%薯干粉成分斜面3、发酵级数的确定谷氨酸：二级发酵摇瓶→一级种子（小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子（发芽罐）→二级种子（繁殖罐）→发酵

一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数链霉素：四级发酵一级种子→二级种子→三级种子→发酵3、发酵级数的确定谷氨酸：二级发酵摇瓶→一级种子（小罐）→发酵级数确定的依据

级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响

级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。

在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面发酵级数确定的依据级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的4、接种量的确定

移入种子的体积接种量＝—————————

接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。

P1474、接种量的确定移入种子的5、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。接种种龄对碱性蛋白酶产生的影响接种量对碱性蛋白酶产生的影响5、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵6、温度大多数微生物的最适生长温度：25~37℃不同生长阶段的微生物对温度的反应不同。原则：延迟期处于最适生长温度，对数生长期略低于最适生长温度，后期主要决定于溶解氧。Q10:在生物学范围内，温度每升高10℃，生长速度加快1倍。6、温度大多数微生物的最适生长温度：25~37℃不同生长阶段7、pH值pH值的作用：影响菌体本身的生命活动；影响酶合成方向。培养过程中发酵液的pH值会发生变化。高碳源培养基倾向于向酸性pH值转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH值转移，变化总结果取决于碳氮比。7、pH值pH值的作用：影响菌体本身的生命活动；影响酶合成方8、通气和搅拌通气量与菌种、培养基的性质及培养阶段有关。不同微生物要求通气量不同，同一菌种在不同生理时期对通气量要求不同培养罐深、搅拌转速大，通气管开孔小或多，培养基粘度小，氧的溶解度大，反之则小。8、通气和搅拌通气量与菌种、培养基的性质及培养阶段有关。不同9、泡沫泡沫形成的原因：机械搅拌和通气使液体分散和空气窜入；代谢活动产生的气泡。泡沫的危害：影响氧的吸收和二氧化碳的排出；降低发酵罐的有效容量；导致跑料和染菌。消泡措施：机械消泡，化学消泡。9、泡沫泡沫形成的原因：机械搅拌和通气使液体分散和空气窜入；10、染菌的控制种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。10、染菌的控制种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子11、种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度质:形态（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P的含量，pH

酶活等无污染11、种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度质:形态（四、种子制备过程举例（一）、谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵四、种子制备过程举例（一）、谷氨酸生产的种子制备制备过程斜1、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5

琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过

3次1、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%2.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培