唾液酸转运体蛋白NanT的分子克隆-异源表达及纯化(完整版)实用资料

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唾液酸转运体蛋白NanT的分子克隆,异源表达及纯化（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）HansJournalofBiomedicine生物医学,2021,6(4,25-30PublishedOnlineOctober2021inHans.文章引用:黄尚谕,史青茹.唾液酸转运体蛋白NanT的分子克隆,异源表达及纯化[J].生物医学,2021,6(4:25-30.MolecularCloning,HeterologousExpression,andPurificationoftheSialicAcidTransporterNanTShangyuHuang1,2,QingruShi1*1YouthScienceandTechnologyGuideStationofBaoshanDistrict,Shanghai2ShanghaiXingzhiHighSchool,ShanghaiReceived:Sep.21st,2021;accepted:Oct.7th,2021;published:Oct.10th,2021Copyright©2021byauthorsandHansPublishersInc.ThisworkislicensedundertheCreativeCommonsAttributionInternationalLicense(CCBY.AbstractSialicacidsarenine-carbonsugaracids,andarefoundwidelydistributedinanimaltissues.Inhuman,thebraincontainshighconcentrationofsialicacids,whicharevitalforneuraltransmis-sion.Thetransportofsialicacidsinvivoiscarriedoutbythemulti-passmembraneprotein,NanT,amembraneoftheSLC17transporterfamily.ThelossoffunctionofNanTwillcausesalladiseaseandinfantilesialicacidstoragedisorder.However,thestructureandmechanismofthesialicacidstransporterremainunknown.Inthisstudy,wecloneandexpresstheNanTprotein.Combiningtheaffinityandsize-exclusionchromatography,weobtainthehighpurityofthetargetprotein.Ourresultsprovideabasisforfurtherexploringthestructureandmechanismofthesialicacidstransporter,NanT.KeywordsSialicAcid,Transporter,NeuralTransmission,SallaDisease唾液酸转运体蛋白NanT的分子克隆,异源表达及纯化黄尚谕1,2,史青茹1*OpenAccess*通讯作者。黄尚谕,史青茹1上海市宝山区青少年科学技术指导站,上海2上海市行知中学,上海收稿日期:2021年9月21日;录用日期:2021年10月7日;发布日期:2021年10月10日摘要唾液酸是一种含有九个碳的单糖的衍生物。广泛的存在于动物体的组织内。尤其是人类的大脑,含有高浓度的唾液酸。这些唾液酸被认为是神经节苷脂的传递递质,对神经传导具有重要意义。唾液酸在体内生物膜上的转运是由一种具有多个跨膜螺旋的膜蛋白NanT介导的。NanT蛋白是SLC17家族转运体蛋白的一员,它的功能丧失会导致扎拉疾病以及婴儿唾液酸积累紊乱。然而唾液酸转运体蛋白的结构以及其底物转运机制目前都是未知的。在这篇文章中,我们克隆并表达了NanT蛋白。结合亲和层析以及凝胶阻滞层析等手段,我们获得了高纯度的NanT目的蛋白。我们的结果为进一步研究NanT的结构以及其底物转运机制提供了很好的基础。关键词唾液酸,转运体,神经传递,扎拉病1.引言脊椎动物的细胞表面修饰着大量的复杂的糖链,这些糖链主要锚定在膜蛋白以及磷脂表面。唾液酸是一种含有九碳单糖骨架的化合物,通常分布在糖链的最外端[1]-[3]。由于唾液酸的定位特殊性及广泛存在性,它通常介导或调控一些重要的生理和病理过程。例如,大量的唾液酸分布在人类血红细胞的表面,可以使血红细胞带有负电性,从而获得电荷排斥效果,在血液环境中这种能力能够阻碍一些非特异的细胞间的相互作用[4]-[6]。另外,大量的唾液酸存在于肾小球基底膜以及足细胞的足突上对维持机体的渗透功能具有重要作用[7][8]。伸展的寡聚唾液酸链还会影响神经细胞的可塑性[9]-[12]。在病理条件下,唾液酸还是影响循环通路中一些糖蛋白半衰期的重要因子,如果唾液酸缺失,潜在的单糖例如半乳糖会被肝脏或其它器官中的受体识别,这样糖蛋白就会被快速的降解清除[13][14]。因此,研究唾液酸转运体蛋白具备重要的生物学意义。2.材料与方法2.1.唾液酸转运体蛋白NanT的基因克隆及表达质粒的构建2.1.1.基因扩增通过聚合酶链式反应(PCR,我们从大肠杆菌菌液中获得了唾液酸转运体蛋白NanT的基因。通过软件PrimerPremier5.0,遵循引物设计的基本原则,我们设计了如下引物(黑体部分表示酶切位点,引物由英骏公司合成:F:5'-GGCGCGCATATGAGTACTACAACCCAGAATATCC-3'R:5'-GACGACTCGAGTTAACTTTTGGTTTTGACTAAATCG-3'2.1.2.PCR产物的回收,酶切与连接通过琼脂糖凝胶电泳我们分离并检测PCR目标产物条带,然后进行目的条带切胶回收(TIANGEN胶黄尚谕,史青茹回收试剂盒。PCR回收的目标产物与载体P22b分别用NdeI和XhoI(Takara公司进行双酶切。酶切反应在37℃恒温水浴锅中进行,反应时间为4小时。酶切后的产物通过回收后,将PCR酶切产物与酶切好的载体进行连接反应(Takara公司SolutionI试剂盒。连接条件为恒温水浴锅10小时。2.1.3.连接产物转化取出DH5α感受细胞(−80℃冻存置于冰上10min使其解冻。然后将连接产物全部加入感受态细胞中,冰上放置30min,42℃恒温水浴锅中热激90s,冰上再放置5min。在超净工作台中加入200µlLB培养基。37℃摇床培养(200rpm40min后把菌液均匀涂布在含氨苄抗生素的固体LB培养平板上,37℃培养箱中过夜培养。2.1.4.抽提质粒并进行阳性筛选取出培养箱中的平板,挑取5个单菌落于5ml含有氨苄抗性的LB培养基小管中,然后置于摇床中,37℃,220rpm培养12小时左右。提取质粒步骤按照质粒小抽试剂盒中的步骤(天根。抽提后的质粒按照基因扩增的PCR程序进行阳性筛选,筛选后的阳性克隆进行保菌并测序。2.2.唾液酸转运体蛋白NanT的表达与纯化2.2.1.转化BL21菌株并进行大量培养将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21表达菌株,37℃培养箱培养过夜后,挑取单菌落于6ml含有氨苄抗性的LB培养基小管中,然后置于摇床中,37℃,220rpm培养12小时左右。继续培养扩大到6瓶(1.5L/瓶LB培养基中,37℃,220rpm培养至OD600=0.8左右。摇床降温到16℃,加入1mM的IPTG进行诱导表达,220rpm继续培养20个小时。离心机6000rpm离心8min收集大肠杆菌,然后将收集后的菌体用bindingbuffer(20mMHEPESpH7.5,150mMNaCl重悬,把重悬液倒至铁制烧杯中,利用超声破碎方法对其进行破碎。超声破碎仪参数设置为工作时间5min,工作2s,间歇4s,功率42%。破碎后的样品按照1.5%加入去垢剂DDM。置于旋转仪室温进行融膜。3h后,18,000rpm离心40min取上清。2.2.2.NanT蛋白的亲和层析我们首先采用Ni2+亲和层析柱(NTA进行蛋白纯化,先用bindingbuffer(20mMHEPESpH7.5,150mMNaCl,1mMDDM平衡柱子,然后把离心上清液缓慢流经柱子。上样完成后,用bindingbuffer冲洗柱子20个柱体积,然后用washingbuffer(20mMHEPESpH7.5,150mMNaCl,1mMDDM,20mMiminazole洗脱10个柱体积去除杂蛋白。最后用elutionbuffer(20mMHEPESpH7.5,150mMNaCl,1mMDDM,300mMiminazole洗脱目的蛋白。2.2.3.NanT蛋白的凝胶阻滞层析收集的目的蛋白液用浓缩管(milipore浓缩至1ml,加入30μlTEV酶进行柱上过夜酶切来除去组氨酸标签,酶切产物用Superdex™200(GEHealthcare分子筛柱子进行进一步纯化,缓冲液为20mMHEPESpH7.5,150mMNaCl,1mMDDM,流速为0.5ml/min,最后用SDS鉴定蛋白纯度。3.结果与讨论3.1.nanT基因扩增我们以大肠杆菌BL21菌株为模板,通过PCR反应,获得了全长NanT蛋白(496个氨基酸残基,共1488个碱基对的编码基因,并通过琼脂糖凝胶电泳进行分离检测(图1,DNA扩增片段在DNAmarker1000bp~2000bp之间,约1500bp符合预期。黄尚谕,史青茹3.2.NanT蛋白的表达纯化通过Ni2+亲和层析柱我们对NanT蛋白进行了初步的纯化,然后用Superdex™200(GEHealthcare分子筛柱子进行进一步纯化,最后通过SDS电泳检测蛋白纯度(图2,同时我们进行多次水平实验,确定纯化提取到的蛋白为目标蛋白。3.3.研究NanT蛋白转运唾液酸机制的生物学意义在体内,唾液酸含量的改变可以体现很多的病理学特征。在临床病理上,体液唾液酸水平的检测可以用于疾病的预测。现在很多的学术论文都建议通过检查血液中的唾液酸含量来检测疾病[15]-[18]。内皮细胞腔表面含有高浓度的唾液酸含量,它的一个重要功能是供淋巴细胞的L-选择素识别[19]。相反,活化的内皮细胞表达E-选择素和P-选择素,它们能够识别淋巴细胞表面的唾液酸。这些选择素介导的相互作用介导了很多重要的生命过程,包括炎症,淋巴细胞循环,血液凝固,再灌注损伤[19][20]。低浓度脂蛋白上的唾液酸对于内皮细胞磷脂的摄取起到重要作用,因此与动脉粥样硬化疾病密切相关[21]-[23]。人类的大脑里面含有最高水平的唾液酸,这些唾液酸对于神经传递具有重要作用[24]。由于唾液酸的广泛分布性及特殊定位,唾液酸常常被一些病原菌做为攻击靶点。例如,流感病毒通过结合唾液酸到达气管上皮细胞,从而达到侵染人类的目的[25][26]。Figure1.AmplificationofPCRgenenanTinEscherichiacoli图1.大肠杆菌nanT基因PCR扩增结果Figure2.NanTproteinSuperdex™200(GEHealthcaremolecularsieveandSDSelectrophoresismap图2.NanT蛋白Superdex™200(GEHealthcare分子筛峰图及SDS电泳图12010080604020OD280(mAUVolume(ml0246810121416黄尚谕,史青茹唾液酸转运体蛋白是一类拥有多个跨膜螺旋的膜插入蛋白,对唾液酸在体内的运输起到决定性的作用,因此它能否正常的发挥功能与人类的多种疾病密切相关。而本文中,我们通过大肠杆菌表达系统,摸索出了唾液酸转运体蛋白NanT的表达及纯化条件,为进一步研究其三维结构和转运机制提供了良好的基础。参考文献(References[1]Schauer,R.(2000Achieveme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水分,。植物为了避免这种,降低细胞的渗透势,从而使水分顺利地进入植物体内,保证植物正常生理活动的进行。渗透调节分为无机渗透调节和有机渗透调节。参与无机渗透调节的离子主要是Na+、K+、Ca2+和Cl2。赵可夫等[2]研究发现盐生植物的无机渗透剂以Na+、K+和Cl2为主,而非盐生植物高粱、芦苇等主要以K+和有机渗透物质为主。说明盐生植物和非盐生植物在渗透调节物质方面的不同。植物在逆境中会主动积累一些有机渗透物质,其中小分子化合物有如下几类:第一类是多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇、右旋肌醇甲醚等;第二类是糖类,如蔗糖、海藻糖等;第三类是氨基酸及其衍生物,如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等。这些物质对细胞无毒,对代谢过程无抑制作用,它们的积累在一定范围内可以维持盐胁迫下细胞的正常膨压和代谢功能。这些保护渗透物质在植物抗盐研究中已越来越受重视。1.2盐胁迫改变代谢途径在盐胁迫下,一些盐生植物能够通过改变其自身的代谢途径而适应高盐度的生存环境。一些肉质植物,如豆瓣绿属植物、马齿苋科植物以及禾本科植物冰草等,在盐渍或水分胁迫下可以改变光合碳同化途径,即由C3途径变为CAM途径。CAM植物在夜间开放气孔进行CO2吸收和固定,白天气孔关闭减少蒸腾量。这种转变的机理,赵可夫等[2]认为主要是Cl-活化了细胞中的RUBP羧化酶所导致的。并通过测量CO2固定和PEP羧化酶活性证实光合作用转变是受盐诱导的。中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005整个光合作用途径的改变是一个十分复杂的过程,涉及到的基因很多,利用改变植物光合作用途径提高植物耐盐性十分困难。1.3盐胁迫下离子的区域化大量的研究表明,植物将吸收的Na+、Cl-等离子积累在液泡中,减少干扰细胞质和叶绿体等的生化代谢过程,这种作用称为离子的区域化作用。Flowers等[3]实验证明,盐生植物和非盐生植物的细胞对Na+都非常敏感,Na+、Cl-的区域化分配是植物对盐渍环境适应的结果。由于离子区域化,使得液泡中Na+浓度远远高于细胞质中的浓度。如高浓度NaCl条件下,生长多代的烟草悬浮细胞系液泡中,积累的NaCl浓度相当高,可达800mmol/L,而细胞质NaCl的浓度仍保持在100mmol/L[4]。研究表明,在NaCl胁迫下,Na+通过质膜进入细胞只有25%左右为主动运输,输,但Na+度的主动运输过程[5]+Cl-Niu[6]滨藜根和叶子质膜上H+2ATPase基因的表达。Dopont[7]证明当外界环境Na+浓度提高,植物通过Na+/H+逆向转运蛋白将Na+转运到液泡中,实现区域化,减少细胞质中的Na+浓度,且在滨藜中Na+/H+逆向转运蛋白活性是被NaCl诱导的。因此,深入研究液泡膜转运蛋白对揭示作物耐盐机理是至关重要的。1.4盐分增加质膜的透性盐分能增加质膜的透性,同时当盐胁迫时,植物体内会产生大量的自由基,从而引起膜质的过氧化,最终导致膜系统的破坏。80年代以来,人们对盐分胁迫下植物体内抗氧化防御系统进行了大量研究,并已确定它由一些能清除活性氧的酶系统和抗氧化物质组成,如超氧化物歧化酶(SOD、过氧化物酶(POD、过氧化氢酶(CAT和抗坏血酸(ASA等,它们协同作用共同抵抗盐分胁迫诱导的氧化伤害,而单一的抗氧化酶则不足以防御这种氧化胁迫。1.5盐渍条件下拒盐和对离子的选择吸收某些盐生植物能通过一些生理机制拒绝或减少对离子的吸收,从而减轻离子所造成的伤害。高粱在1000mmol/LNaCl中胁迫7天后,其根和茎部木质部液中Na+比穗轴木质部中Na+要高十几倍,小麦、甜菜、玉米等在盐的胁迫下其根Na+也要比地上部分高3～7倍[8]。说明根具有抑制Na+吸收和向地上运输的机能,对于这种限制移动的控制机制目前人们认为涉及以下过程:(1+,即使进,就是进入内皮细+Na+局限于细胞间隙中;(Na+被吸入液泡,并将其封闭在液泡,阻止Na+向叶片运输;(3植物体内把进入导管内的Na+向导管外排出,Na+聚积在与导管相邻的薄壁组织细胞中,同时将移动到地上部分的Na+从导管渗进筛管,再将其返送到根部。植物通过这种机制保持细胞质有极低渗透势,以抵消液泡渗透势的降低,对减轻高盐对植物损伤有重要作用。2耐盐相关基因的克隆2.1近年来克隆到的盐诱导基因近20年来,随着分子生物学的迅速发展,作物耐盐生理生化机制日益明确,使克隆与作物耐盐相关基因成为可能,近年来克隆到的部分基因见表1。表1近年来克隆到的部分盐诱导基因Table1Partialgenesclonedforsalttolerance基因来源功能资料来源基因登录号AhProTi榆钱菠菜脯氨酸转运蛋白申义国等[9]AF270651P5CS大豆脯氨酸合成酶Delauney等[10]AY492005SOS1拟南芥反转运蛋白基因Shi等[11]AF256224BADH细菌甜菜碱脱氢酶Larimer等[12]BX572595SsAPX盐地碱蓬过氧化物酶马常乐等[13]AY034893CDPKI拟海桑钙调蛋白基因Huang等[14]AY466385TaNHX1小麦Na+/H+反转运蛋白基因王子宁等[15]AY040245SacB枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶Rey等[16]NC006270DsALDP盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶张晓宁等[17]AY092823622005,25(8崔润丽等:植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展2.2耐盐相关基因的分类根据基因产物的不同,可将现已克隆的基因分为以下几类。2.2.1渗透调节有关的基因这些基因在正常条件下表达量极低,但是在盐胁迫条件下会大量表达并产生一些小分子有机物,如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等。通过这些小分子物质维持细胞渗透势,提高植物的耐盐性。(1脯氨酸合成相关基因1990年,Delauney等[10]在大豆中发现P5CS酶与渗透调节有关,由此提取mRNA,反转录获得cDNA,进一步筛选得到了P5CS基因。到目前为止,P5CS基因已经从紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻等物种中得到克隆和鉴定,不同生物的P5CS基因具有较高的同源性。在紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻中的研究表明:盐处理或干旱条件下P5CS基因转录水平有很大程度的提高,并最终导致了脯氨酸含量的增加[18]。(2成相关基因Falkenberg等[19]cDNA片段,并证明与脱酶(BADH的活性有关McCue等[20]从甜菜的λ10cDNA文库中克隆了3个负责编码BADH的cDNA,发现其氨基酸序列与菠菜的BADH具有83%的同源性。BADH和CMO等基因已应用到耐盐植物基因工程研究中。2.2.2与离子区域化相关的基因液泡膜上的Na+/H+反转运蛋白直接参与了Na+在液泡中的积累。王子宁等[15]以水稻Na+/H+反转运蛋白cDNA为探针,从小麦盐胁迫的cDNA文库中筛选和克隆了2个Na+/H+反转运蛋白基因,分别命名为TaNHX1和TaNHX2。这2个基因与已知的水稻、拟南芥和滨藜中的同类基因NHX的相似性约为70%。RT2PCR分析表明,小麦苗经400mmol/L的NaCl处理1h后TaNHX1基因的转录水平有所提高。Shi等[11]从拟南芥中克隆了1个Na+/H+反转运蛋白基因SOS1,并证明SOS1基因是Na+和K+在液泡中富集所必需的,与植物耐盐性直接相关。SOS1基因所编码的蛋白质跨膜结构域与已知的真核生物和细菌的该基因具有显著的同源性。Apes等[21]将1个编码液泡膜Na+/H+反转运蛋白的基因转入拟南芥,证明其耐盐性显著增强,可在含盐量为200mmol/L的NaCl土壤中生长。此外,还有其他关于Na+/H+反转运蛋白基因的报道,目前大家一致认为Na+/H+反转运蛋白基因对离子的区域化具有重要作用。2.2.3保护酶基因保护酶(尤其是SOD是人们研究在1989年就已经获得了,SOD基因,包括Fe2/SOD基因既有单拷,线粒体和叶绿体中的SOD是在核内合成后再分泌到细胞器中的。多数SOD基因的表达都具有组织特异性,并受许多环境因素的影响。赵风云等[22]的研究表明,水稻的Mn2SOD基因(sodA1可由ABA、干旱、盐胁迫诱导,而Fe2SOD基因则由ABA诱导,质体的Cu/Zn2SOD基因(sodCp由盐胁迫在光下诱导而黑暗条件下则不诱导。这些现象说明不同的SOD基因表达受不同的因素诱导,因此仅转入1个或1种类型的SOD基因难以提高植物的耐盐能力。3转基因耐盐植物研究进展尽管人们已经发现并克隆了许多与耐盐相关的基因,但仅有少量基因被用于转化工作。近年来获得的主要转耐盐相关基因植物见表2。表2近年获得的主要转耐盐相关基因(或转录因子植物Table2Recenttransgenicplantsforsalttolerance基因转入植物转基因植物的表现资料来源BADH小麦、烟草抗渗透耐盐、耐旱能力明显提高刘凤华等[23]mtlD/gutD水稻耐盐能力较转它们的单基因植物明显增强刘俊君等[24]P5CS水稻幼苗抗盐能力显著增强苏金等[25]gutD玉米具有较高的耐盐性,可在1.75%NaCl培养基上生长刘岩等[26]SOD紫花苜蓿显著提高植物的耐盐性Apes等[21]NHXVP1烟草抗性提高,可在盐胁迫条件下生长赵风云等[22]AtNHX1拟南芥基因转录产物在根、嫩枝、花中的含量提高McKersie等[27]AhproTi拟南芥可耐受200mmol/LNaCl,并可持续生长申义国等[9]DsALDP烟草在100～200mmol/LNaCl下仍保持醛缩酶活性张晓宁等[17]SOS1水稻显著提高耐盐性Ohta等[28]Apx大麦显著提高耐盐性Ishitani[29]72中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.82005目前获得的一些转基因植物耐盐性虽有提高,但这只是相对于对照植株而言的,转入均是单个基因或相关的两个基因,并没有得到生产大田能利用的抗盐植株。目前比较一致的观点是:植物的耐盐性是多种生理性状的综合表现,是由位于不同染色体上的多个基因控制的,因此培育有实践意义的转基因植物可能需要同时转入多个基因。3.1导入编码产生渗透调节物质的酶基因刘凤华等[23]利用农杆菌介导法,将BADH基因导入草莓和烟草中获得转基因植株,鉴定表明:转基因植株的耐盐性较对照明显提高,并利用PCR检测证明耐盐性的提高是由于外源BADH表达的结果。苏金等[25]获得的转基因水稻提高了脯氨酸水平,秧苗对100～150mmol/LNaCl具有一定的抗性。除脯氨酸和甘氨酸甜菜碱外,其他渗透调节物质,如甘露醇和山梨醇合成的关键酶12磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD和62磷(]等[26]将这2,分别获得在1.75%NaCl培养基中有一定耐盐能力的转基因植株。3.2导入与离子区域化效应有关的基因Ohta等[28]将Na+/H+反转运蛋白基因转入水稻,在水稻中超表达该基因,发现其木质部蒸腾流中Na+的含量明显降低,植物的耐盐性增强,显示可以通过限制Na+在植物细胞中的积累来提高植物的耐盐性。赵风云等[22]从SuaedaSalsa中克隆到Na+/H+反转运蛋白基因,并证明该基因对植物的耐盐性至关重要。Apes等[21]将一编码液泡Na+/H+反转运蛋白基因转入拟南芥使其超表达,结果表明,该转基因植株能够在NaCl含量为200mmol/L的土壤中生长发育,比对照耐盐性显著提高,可见转入与离子区域化效应有关的基因可显著提高植物的耐盐性。4导入耐盐植物的总DNA将耐盐植物的总DNA直接导入大田作物来提高其耐盐性也是近几年来遗传工程研究中的一个重要方面。林栖凤等[30]利用花粉管通道技术,将海岸耐盐植物红树的DNA导入茄子,获得的转化后代已在海滩上试种,可以用含盐量2.5%的海水浇灌,约90%的植株能开花结果,完成生长周期,并对其在盐胁迫下的生长情况、蒸腾速率、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性以及叶片气孔的电镜观察等进行了研究,实验结果表明,导入红树DNA培育的茄子耐盐能力明显增强,已繁殖到第三代,而对照植株几乎全部死亡。综上所述,尽管不同的研究者从诸多方面对植物的耐盐机理作了大量的研究,并已达到了一定的广度和深度,但由于植物耐盐性是一个受多基因控制的复杂的数量性状,它受植物种类、品种基因型和内部生理生化反应的影响,离实际生产和应用还有相当大的距离。我们虽然了解了一些盐胁迫条件下作物的反应变化,但我们却不能确定哪一种反应是主要的,利用的可能性有多大,产生的耐盐效应有多大。在转基因植物方面,虽然得到了一些转基因植物,但如何协调好外源基因与内源基因的关系,控制好基因表达时间和表达量,避免对作物的消极影响等问题还有待进一步研究。,。参考文献[1]LevittJ.ResponseofPlantstoEnvironmentalStress(VolII.2nded.NewYork:AcademicPress,1980.102～106[2]赵可夫,李法曾.中国盐生植物.北京:科学出版社,1999.191～200ZhaoKF,LiFZ.HalophyteinChina.Beijing:SciencePress,1999.191～200[3]FlowersTJ,HarveyDMR.Ionsrelationofsalttolerance.AustralianJournalofPlantPhysiology,1997,24:89～91[4]张福锁.植物营养生态生理学和遗传学.北京:中国科学技术出版社,1993.206～230ZhangFS.PlantNutritionEcophysiologyandGenetics.Beijing:ChinaScienceandTechnologyPress,1993.206～230[5]王宝山,赵可夫,邹奇.作物耐盐机理研究进展及提高作物耐盐性的对策.植物学通报,1997,33(6:423～426WangBSH,ZhaoKF,ZouQ.ChineseBulletinofBotany,1997,33(6:423～426[6]NiuXM,ZhuJK,NarasimhanML,etal.PlasmamembraneH+2ATPasegeneexpressionisregulatedbyNaClincellofthehalophyteAtriplexnummalariaL.Planta,1993,190:433～438[7]DopontFM.Salt2inducedchangesiniontransport:regulationofprimarypumpsandsecondarytransporters.In:ClarksonDTed.TransportandReceptorProteinsofPlantMembranes.NewYork:PlenumPress,1992.91～100[8]MicheletB,BoutryM.TheplasmamembraneH+2ATPaseahighlyregulatedenzymewithmultiplephysiologicalfunctions.PlantPhysiol,1995,108:1～6[9]申义国,闫冬青,张万科,等.榆钱菠菜脯氨酸转运蛋白基因的克隆及转拟南芥的耐盐性.植物学报,2002,44(8:956～962ShenYG,YanDQ,ZhangWK,etal.ActaBotanicaSinica,2002,44(8:956～962[10]DelauneyAJ,VermaDPS.AsoybeangeneencodingΔ12pyrroline2s2carboxylatereductasewasisolatedbyfunctional822005,25(8崔润丽等:植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展complementationinE.coliandisfoundtobeosmoregulated.MolGenGendt,1990,221:299～305[11]ShiH,IshitaniM,KimC,etal.TheArabidopsisthalianasalttolerancegeneSOS1encodesaputativeNa+/H+antiporter.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(12:6896～6901[12]LarimerFW,ChainP.CompletegenomesequenceofthemetabolicallyversatilephotosyntheticbacteriumRhodopseduomonaspalustris.NatBiotechnol,2004,22(1:55～61[13]马常乐,王萍萍,曹子谊,等.盐地碱蓬APX基因的克隆及盐胁迫下的表达.植物生理与分子生物学学报,2002,28(4:261～266MaCHL,WangPP,CaoZY,etal.JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2002,28(4:261～266[14]HuangJ,MullapudiN.FirstglimpseintothepatternandscaleofgenetransferintheApicomplexa.IntJParasitol,2004,34(3:265～274[15]王子宁,张劲松,郭北海,等1小麦Na+/H+反转运蛋白基因的克隆和特性.植物学报,2002,44(10:1203～1208WangZN,ZhangJS,GuoBH,etal.ActaBotanicaSinica,2002,44(10:1203～1208[16]ReyMW,RamaiyaP.CompleteindustrialBmBi2004,5:77～80[17]张晓宁,林长发,.受NaCl诱导的盐藻果糖21,62二磷酸醛缩酶cDNA的克隆及其在烟草中的表达.中国科学,2002,32(5:392～398ZhangXN,LinCHF,ChenHY,etal.ScienceinChina,2002,32(5:392～398[18]郭蓓,邱丽娟,李向华,等.植物盐诱导基因的研究进展.农业生物技术学报,1999,7(4:401～408GuoB,QiuLJ,LiXH.JournalofAgriculturalBiotechnology,1999,7(4:401～408[19]FalkenbergP,StormAR.PurificationandcharacterizationofosmoregulatorybetainealdehydedehydrogenaseofE.coli.BiochimBiophysActa,1990,1034:253～259[20]McCueKF,HansonAD.Salt2induciblebetainealdehydedehydrogenaseformsugarbeet:cDNAcloningandexpression.PlantMolecularBiology,1992,18(1:1～11[21]ApesMP,AharonGS.SalttoleranceconferredbyoverexpressionofavacuolarNa+/H+antiportinArabidopsis.Science,1999,285:1256～1258[22]赵风云,郭善利,王增兰,等1耐盐转基因植物研究进展1植物生理与分子生物学报,2003,29(3:171～178ZhaoFY,GuoSHL,WangZL,JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2003,29(30:171～178[23]刘凤华,郭岩,陈受宜,等.转甜菜碱脱氢酶基因植物的耐盐性研究.遗传学报,1997,24(1:54～58LiuFH,GuoY,ChenSHY,etal.ActaGeneticaSinica,1997,24(1:54～58[24]刘俊君,彭学贤,王慧中,等.转mtlD/gutD双价转基因水稻的耐盐性.科学通报,2000,45(7:724～729LiuJJ,PengXX,WangHZH,etal.ChineseScienceBulletin,2000,45(7:724729[25]苏金,陈丕铃,吴瑞,等12P脱氢酶转基因表达对转.中国农业科学,1999,32:～L,WuR,etal.ScientiaAgriculturaSinica,32(6:101～103[26]刘岩,王国英,张福锁,等.大肠杆菌gutD基因转入玉米及耐盐转基因植株的获得.中国科学,1998,28(6:542～547LiuY,WangGY,ZhangFS,etal.ScienceinChina,1998,28(6:542～547[27]McKersieBD,BowleySR,JonesKS.Wintersurvivaloftransgenicalfalfaoverexposingsuperoxidedismutase.PlantPhysiol,1999,119:839～847[28]OhtaM,HayashiY.IntroductionofaNa+/H+antiportergeneformAtriplexgmeliniconfersalttolerancetorice.FEBSLett,2000,532(3:279～282[29]IshitaniM.Expressionofthebatainealdehydedehydrogenasegeneinbarlyinresponsetoosmoticstressandabscisicacid.PlantMolecularBiology,1995,27(2:307～315[30]林栖凤,李冠一.红树DNA导入茄子获得耐盐性后代的研究.生物工程进展,2001,21(5:40～44LinQF,LiGY.ChinaBiotechnology,2001,21(5:40～44AdvancesonCloningandTranslationoftheSaltToleranceGenesinPlantCUIRun2li2DIAOXian2min1,2(1TheNationalMilletImprovementCenter,InstituteofMillet,HebeiAcademyofAgricultureandForestShijiazhuang050031,China(2CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversityShijiazhuang050016,ChinaAbstractSalinityisoneofthemajorconstrainsincropproductionallovertheworld.Tryingtounderstandthemechanismofsalttoleranceandbreedingofsalttoleranttransgenicplantisahotpointinplantscience.Theprogressinfouraspectsofthisfieldincludingharmfulnessofsalinity,mechanismofsalttolerant,cloningofsalttolerantrelatedgenesandbreedingofsalttoleranttransgeniccropswerereviewed.Thecomlexityofsalttolerantmechanismandtheprospectofsalttolerantmolecularbreedingwerediscussed.KeywordsSalinityThemechanismofsalttolerantGenecloningTransgene92收稿日期:2007-06-10基金项目:宁夏自治区科技攻关项目(06273;教育部科学技术研究重点项目(03142作者简介:杨敏丽(1965-,女,教授,博士,研究方向为天然药物化学的开发与应用。金银花中绿原酸的分离纯化工艺研究杨敏丽,郝凤霞(宁夏大学能源化工重点实验室,宁夏银川750021摘要:目的:对金银花中的绿原酸的提取、分离工艺进行研究。方法:绿原酸经乙醇热回流提取后,采用聚酰胺柱层析法进行分离除杂,对主要工艺参数进行了优化。结果:将待分离的绿原酸粗品和聚酰胺(80~100目按物料比1:5装入柱径与柱长比为1:7的层析柱中,常压下用10%的乙醇以最大流速洗脱至14倍柱体积,收集绿原酸含量较高(A322/A216≥0.9的流分,浓缩后得到纯度为70%的绿原酸产品,经重结晶后纯度可提高到93%。结论:该工艺简单、成本较低,适于工业化。关键词:金银花;绿原酸;聚酰胺柱层析;分离;纯化StudyonIsolationandPurificationofChlorogenicAcidinFlosLoniceraeYANGMin-li,HAOFeng-xia(KeyLaboratoryofEnergySourcesChemicalEngineering,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,ChinaAbstract:Objecive:Tostudytheisolationandpurificationconditionsofchlorogenicacid(CAfromFlosLonicerae.Method:TheisolationandpurificationofCAwereachievedbypolyamidecolumnchromatographyandthemainisolationfactorswereoptimized.Results:Theoptimumisolationisasfollowing:therateofcrudeCAtopolymideis1:5,therateofdiametertolongis1:7,10%alcoholwashedathighspeedunderusualpressure,CAiscollectedbetweenthevolumeof5~14timesofcolumnvolume(A322/A216≥0.9,undertheconditions,theproductwithabove70%CAisobtained,whichcanbefurthercrystalledbyEtoAcandthepurityisenhancedto93%.Conclusion:Thismethodissimple,lowcost,andsuitabletobeusedinindustry.Keywords:FlosLonicerae;chlorogenicacid;polyamidecolumnchromatography;isolation;purification中图分类号:Q946.8文献标识码:A文章编号:1002-6630(200707-0255-05金银花属忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb的干燥花蕾或初开的花,是传统的清热解毒常用中药[1],其主要活性成分为绿原酸。绿原酸是一种多酚类化合物,异名咖啡鞣酸,是植物在有氧呼吸过程中产生的苯丙素类化合物[2]。绿原酸具有抗菌、抗病毒、止血、抗氧化、消除自由基、抑制突变和抗肿瘤等多种生物活性[3-5],在医药、卫生等领域具有很大的应用价值,因此,从植物中提取分离绿原酸具有重要的意义。目前,有关绿原酸的分离方法主要有沉淀法,萃取法,大孔树脂法等[6-9],沉淀法简单,但在碱性条件下,绿原酸易发生水解,得率低;萃取法产品质量有所提高,但工序复杂,需大量有机溶剂;大孔树脂法分离速度快,但除杂效果不理想,所得产物绿原酸含量较低。本实验以金银花的花蕾为原料,采用乙醇热回流法提取绿原酸,然后以聚酰胺为吸附剂,通过聚酰胺柱层析对粗提物进行分离除杂,并对影响分离的主要工艺参数进行了优化选择,在优化的工艺条件下,可得到纯度为70%的绿原酸产品,经乙酸乙酯重结晶后,产品纯度可提高到93%。该方法工艺简单,成本低,可以为绿原酸的工业化提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂金银花采自宁夏固原市原州区。绿原酸标准品中国药品生物制品检定所;甲醇(色谱纯、磷酸(分析纯天津化学试剂;乙醇(工业级宁夏银川市好利顿酒业;聚酰胺为80~100目浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂。1.2仪器玻璃层析柱Φ2.5×50cm上海沪试分析仪器有限工艺流程图分离工艺正交试验法优化了乙醇提取绿原酸的工艺,结果表明,当乙醇浓度为70%,料液比为1:8,提取时间为3h,共提取三次时,绿原酸的得率最高。在优化的工艺条件下,将乙醇提取液过滤,浓缩,拌入聚酰胺,真空烘干,研磨,过筛,得粗品,经聚酰胺柱层析分离,以产品得率和产品纯度(绿原酸含量为指标,分别考察了聚酰胺目数、洗脱剂、物料比、柱径与柱长比、流速、洗脱剂用量等影响因素,优化出最佳的分离工艺参数。对分离后的产品,选用不同的溶剂进行重结晶,标准溶液的配制精密称取绿原酸标品5.0mg,置50ml容量瓶中,加50%甲醇溶解并定容至刻度,摇匀得0.1mg/ml的标液。分别吸取1、3、5、7、9ml标液于五个10ml容量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,得到系列标准溶液。色谱条件的选择标准曲线的制作将一系列不同浓度的标准溶液按以上色谱条件测定,记录峰面积,并对样品浓度作图,得线性回归方程为:y=14613.54x-3.09,r=0.9999;绿原酸在0.01~0.09mg范围内呈良好的线性关系。2结果与分析以0.2mol/L的HCl为溶剂,绿原酸标品在322nm和216nm处两个吸收峰,这两个波长下吸光度的比值(A322/A216为1.37,研究发现,当产品中绿原酸含量变化时,这个比值也随之改变,产品纯度越高,比值越接近1.37,反之,产品纯度越低,比值越小。如当产品中绿原酸含量为37.8%,A322/A216为0.94,而当产品中绿原酸含量为49.7%,A322/A216为1.08。因此,可以通过测量这个比值大小初步判断产品中绿原酸的纯度。2.1聚酰胺目数和洗脱剂的选择分别称取目数不同的两种聚酰胺(80~100目、100~200目各7.0g,装入柱长和内径完全相同的柱子,将绿原酸的粗提液浓缩后拌入适量聚酰胺,烘干,研磨,过60目筛,记为绿原酸粗提物。称取该粗提物1.0g,两份,分别装入目数不同的两根柱子顶端,然后依次用等体积的水和10%~40%乙醇洗脱,收集各自粉碎1.240%的乙醇A322/A216洗脱剂80~100目100~200目30%的乙醇20%的乙醇10%的乙醇水图1聚酰胺目数和洗脱剂的选择Fig.1Selectionofpolyamideandsolvent200160120804040%的乙醇绿原酸质量(mg洗脱剂80~100目100~200目30%的乙醇20%的乙醇10%的乙醇水由图3和表2可以看出,在物料比为1:5的前提下,当柱径与柱长比为1:7时,流分中绿原酸出现较集中,所得产品的绿原酸纯度最高,产品得率无明显差别,故选择1:7为合适的柱径与柱长比。2.4流速的选择称取8.0g聚酰胺(80~100目两份,装入两根相同柱子(2.0cm×14.0cm中,柱径与柱长比为1:7,称取2.7g粗品(含绿原酸粗品1.6g两份,分别装入柱子顶端,使物料比为1:5,用10%的乙醇洗脱,分别调节柱子的活塞至最大流速(2.2ml/min及较小流速(1.2ml/min处,比较不同流速下绿原酸的洗脱效果,优选出较理想的洗脱速度。由图4可以看出,当流速为2.2ml/min和1.2ml/min的洗脱液,以洗脱液中绿原酸的含量(A322/A216和质量为指标,比较不同目数的聚酰胺和不同洗脱剂对绿原酸的分离提纯效果。结果见图1。由图1可以看出,聚酰胺的型号对绿原酸的分离效果影响不大,但100~200目的聚酰胺分离速度明显小于80~100目的聚酰胺,故选择80~100目的聚酰胺柱层析法分离绿原酸的吸附剂。用不同的洗脱剂进行洗脱时,发现当洗脱剂为10%乙醇时,绿原酸质量和绿原酸含量都是最高的,所以选择10%乙醇为聚酰胺柱层析的洗脱剂。2.2物料比的选择称取8.0g聚酰胺(80~100目三份,装入柱长内径完全相同的柱子(2.0cm×14.0cm,分别称取4.5、2.7、1.35g拌入聚酰胺后粗品(含绿原酸粗品分别为2.7、1.6、0.8g,装入相同的三根柱子顶端,使物料比(绿原酸粗品与聚酰胺质量比分别为1:3、1:5、1:10,用10%的乙醇洗脱,一倍柱体积为一流分别收集,对每个流分别进行紫外扫描,计算每个流分中的绿原酸的含量(A322/A216,当A322/A216≥0.9时,流分与绿原酸标准品的紫外图谱比较相似,故合并A322/A216≥0.9的流分,浓缩、干燥得绿原酸产品,比较不同物料比所得产品得率和产品中绿原酸的纯度,优选出一种理想的物料比。表1物料比对产品得率和绿原酸纯度的影响Table1EffectsofrateofcrudeCAtopolymideo