灵芝多糖纯化过程中的去蛋白方法研究

灵芝多糖纯化过程中的去蛋白方法研究

灵芝，又名红芝、丹芝、红芝、紫芝和黑芝，是多孔植物科的一个子实体。我国利用灵芝已有上千年的历史,在很多古代医学典籍中都有对灵芝性质及药效的记载,如《神农本草经》、《本草纲目》等都极为肯定和详细地记载了灵芝的功用。现代科学研究证实,灵芝中富含多糖、三帖类物质等,它们在灵芝的功能中发挥着很重要的作用。近年来,关于灵芝多糖在免疫调节、抗肿瘤、清除自由基和抗衰老等方面的功效及机理倍受国内外学者的关注。据文献报道,自由基是细胞衰老的主要诱因,进而对人体的健康造成影响。研究已经证实灵芝多糖作为一种生物活性分子在清除超氧阴离子和羟基自由基方面具有一定的作用。本研究以不同灵芝多糖在体外化学体系中对羟基自由基和超氧阴离子的清除率为研究对象,探索不同来源灵芝多糖的抗氧化性及多糖浓度与清除羟基自由基和超氧阴离子能力的相关性,旨在为开发灵芝类系列功能食品提供依据。1材料和方法1.1材料表面灵芝子实体来源于湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所灵芝生产基地;所用试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1乙醇的提取(1)灵芝子实体处理。将一定颗粒细度的适量灵芝粉末放在高体积分数乙醇中浸泡过夜,待用,以去除部分脂类和色素。用20L旋转蒸发仪回收乙醇,醇提后的残渣置于阴凉通风处风干;(2)子实体多糖的粗提取。精确称量经干燥的灵芝粉,按料液比1∶30(W/V,g∶mL,下同),提取3h,经过抽滤后,在废渣中再加入1∶20的溶剂提取2h,合并两次提取液,真空浓缩至原体积的20%左右。1.2.2测定茶多酚含量1.2.3变性蛋白质提取(1)Sevag法。按三分之一体积加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇=4∶1),混合振荡20min,静置15min,除去水层与溶剂交界处的变性蛋白质,重复多次,直至无变性蛋白质出现为止;(2)HCl法。往浓缩液中加入盐酸,用pH计调浓缩液pH值至3.0,静置过夜,3500r/min离心15min,去除底部沉淀。得脱蛋白液。1.2.4gl1,gl2的离心表达取去蛋白之后的灵芝多糖浓缩液,加入一定量的95%乙醇,使其体积分数为40%,醇沉过夜,3500r/min离心15min,收集沉淀,冷冻干燥,得到的多糖记为GL1,上清液记为V1;取前次离心上清液V1,加入一定量的95%乙醇,使其体积分数为65%,醇沉过夜,3500r/min离心15min,收集沉淀,冷冻干燥,得65%醇沉量,得到的多糖记为GL2,上清液记为V2;吸取经过处理的上清液V2,加入一定量的95%乙醇,使最终体积分数为80%,醇沉过夜,3500r/min离心15min,收集沉淀,冷冻干燥,得到的多糖记为GL3。1.2.5不同浓度感官质中邻苯三酚的清除1)羟基自由基清除率。取1.0mL0.75mol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中,依次加人2.0mL0.20mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)和1.0mL蒸馏水,充分混匀,加入1.0mL新配制的0.75mmol/L硫酸亚铁溶液(FeSO4),混匀后,再加入1.0mL新配制的0.01%H2O2,于37℃水浴中加热60min后于510nm处测其吸光值,所测得数据为损伤管的吸光值A2。未损伤管以1.0mL蒸馏水代替损伤管中1.0mL新配制的0.01%H2O2,操作方法同损伤管,可测得510nm处未损伤管的吸光值A1。样品管以1.0mL样品代替损伤管中的1.0mL蒸馏水,操作方法同损伤管,可测得510nm样品管的吸光值A3。计算清除率,根据结果绘制灵芝多糖浓度-清除率曲线。清除率=(A3-A2)/(A1-A2)×100%2)超氧阴离子清除率。取3.0mL50.00mmol/LTris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)于试管中,25℃水浴中预热20min,取出后立即加入2.0mL不同浓度的待测样品和0.4mL5.00mmol/L邻苯三酚,混匀后25℃水浴保温4min,立即加入8.00mol/LHCl溶液0.1mL终止反应,在420nm处测定吸光值A样品,对照组用蒸馏水2.0mL代替样品。A空白用0.4mL蒸馏水代替邻苯三酚,另用3.0mL50.00mmol/LTris-HCl缓冲溶液加2.5mL水调零。根据所测吸光度值,计算分级醇沉的灵芝多糖及对超氧阴离子的清除率。清除率=(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100%2结果与分析2.1不同失率sevag法多糖损失率及蛋白去除率结果试验结果表明,Sevag法和HCl法都可以去除灵芝多糖提取液中的杂蛋白,但两种方法去蛋白效果和多糖损失率不同,Sevag法多糖损失率为36.03%、蛋白去除率为82.41%;而HCl法多糖损失率为14.41%、蛋白去除率为41.60%(图1),Sevag法去蛋白效果优于HCl法,但多糖损失较多,从多糖损失率和蛋白去除率两方面综合考虑,Sevag法较好一些。Sevag法多糖损失率高和操作次数多有关。2.2沉淀多糖的量不同体积分数乙醇分级醇沉灵芝多糖研究显示出65%乙醇沉淀出的灵芝多糖(GL2)的量最大,占醇沉多糖总含量的41.95%;其次是40%乙醇的沉淀多糖量(GL1),为41.03%;80%乙醇沉淀多糖的量(GL3)最少,仅为17.02%(图2)。40%和65%醇沉的多糖占醇沉多糖总含量的82.98%。这种现象的原因可能是因为灵芝多糖浓缩液先经40%和65%的乙醇沉淀,然后才是80%乙醇醇沉,导致先醇沉的多糖量偏高,再就是与灵芝多糖的分子量有关,分子量大的多糖先醇沉出来,分子量小的后醇沉出来。2.3gl2和gl2对羟基自由基清除能力的比较见表1图3所示的结果表明,灵芝多糖清除羟基自由基的能力是随多糖浓度的升高而增大,反应体系中加入0.1mLGL2溶液时清除率为12.95%,加入0.2mLGL2溶液时清除率为27.27%,加入0.3mLGL2溶液时清除率为49.17%,而在加入0.4mLGL2溶液时,清除率达76.45%,是加入0.1mLGL2溶液时的6倍。进一步分析相同浓度下(每只试管均含1.9mg多糖)反应体系中GL1、GL2、GL3对羟基自由基清除能力的差异。由图4可知,相同浓度醇沉的多糖清除羟基自由基能力大小顺序为:GL3>GL1>GL2,其中,GL2对羟基自由基清除率最低,仅为19.17%,GL1对羟基自由基清除率为21.75%,而GL3对羟基自由基清除率达到25.31%,比GL2清除率高了6.14%,比GL1清除率高了3.56%。2.4离子的清除率图5的结果表明,灵芝多糖的抗氧化性是跟多糖浓度正相关,多糖浓度越高,抗氧化性越强,对羟基自由基的清除率和超氧阴离子的清除率也更强。进一步分析探讨GL1、GL2、GL3在相同浓度(即每试管均含2.0mg多糖)的情况下对超氧阴离子清除能力的差异(图6)可知,不同多糖在相同浓度下对超氧阴离子的清除率存在较大差异,GL3对超氧阴离子的清除率最高,达到了56.95%,GL1清除率次之,为42.87%,GL2对超氧阴离子清除率最低,仅为37.21%。3不同浓度gl3和gl2对活性的影响Sevag法和HCl法是多糖纯化过程中常用的两种方法,但这两种去蛋白方法的原理不同,Sevag试剂可以使蛋白质变性,进而析出,而HCl法利用蛋白质在等电点附近溶解度最低的原理,从而使蛋白质析出。Sevag法和HCl法都可以去除灵芝多糖提取液中的杂蛋白,但是蛋白去除率和多糖损失率不同,Sevag法比HCl法去蛋白效果要好,但是多糖损失较多,原因与Sevag法去蛋白过程中洗脱次数有关。综合比较,Sevag法的效果相对较好。自由基是人体生命过程中生物化学反应产生的中间产物,体内自由基过多或清除缓慢均会引起分子、细胞甚至器官损伤,导致病变。结果表明,灵芝多糖具有直接清除羟基自由基和超氧阴离子的能力,且清除能力与多糖的浓度呈正相关,随多糖浓度的提高清除率可达到70%以上。不同体积分数乙醇沉淀得到的灵芝多糖清除羟基自由基的能力不同,以GL3清除率最高,具体原因需要进一步研究。另一方面,GL3在总的灵芝多糖中的含量较低(GL1∶GL2∶GL3=0.41∶0.42∶0.17),因此总体来看灵芝中可能还是GL1和GL2在灵芝抗氧化中发挥主要作用。另一方面,本试验只是在化学体系中测得,因为生物体的复杂性,灵芝多