辨体调理膏制剂工艺的优化

辨体调理膏制剂工艺的优化

冬季用药已成为人们恢复和调节身体、纠正健康状况的最受欢迎的方法之一。辨体调理膏是我院使用人数最多的膏方,是由多位名老中医研究得出的用于冬令滋补调理的代表方剂。全方由银杏200g,山药120g,薏苡仁200g,山楂250g,陈皮120g,红枣120g,核桃200g,芝麻200g,龟甲胶250g,阿胶250g,冰糖250g组成,药味少而经典,主治劳倦内伤、气弱血虚、阳浮外越,并且它也是组成各类膏方的基础方药,临床应用十分广泛。目前,辨体调理膏是按传统经验制备,各批次膏方会有一定的质量差异,也可能导致临床疗效的不同,因此,对其制剂工艺的研究十分必要。国内外文献报道膏方的制剂研究很少,还没有形成一套严谨规范的工艺流程,本研究将对膏方制备过程中的几个重要环节,包括药材煎煮条件、煎煮容器、胶类药烊化等进行研究,以确定辨体调理膏的最佳工艺条件,从而保证有效成分含量的稳定性和膏方质量的可靠性,达到安全、有效用药的目的。1仪器、试剂和仪器Agilent1100高效液相色谱系统(AgilentTechnologies,USA),配四元梯度泵、在线脱气机、紫外检测器、ChemStation工作站控制系统;TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司,中国);METTLERAE240电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司,中国);MinispanPlus台式高速离心机(杭州奥盛仪器有限公司,中国);MILI-Q超纯水系统(Millipore,USA);KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,中国)等。标准品橙皮苷(纯度≥99.0%)购于中国药品生物制品检定所;明胶(BC)、硫酸铜(AR)、四水合酒石酸钾钠(AR)均购自上海晶纯试剂有限公司;氢氧化钠(AR)购于杭州萧山化学试剂厂;乙腈(特级色谱纯)和甲醇(一级色谱纯)购于天津市四友生物医学技术有限公司;甲酸(AR)购自上海国药集团化学试剂有限公司;辨体调理膏及其原料药材由本院中药房提供。2方法和结果2.1a/vv/v乙腈+乙腈b相AglientZORBAXSB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5.0μm);流动相:水相D相为0.05%甲酸-水(V/V),有机相B相为乙腈,梯度洗脱,0～7min,8%～15%B,7～16min,15%～20%B,16～20min,20%～24%B,20～24min,24%～24%B,24～30min,24%～85%B,30～35min,85%～95%B,流速为0.8mL/min;进样量为20μL;柱温为25℃;检测波长为280nm。2.2水合酒石酸钾钠knac4h4h3.4h2o的制备称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.75g、四水合酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)3.0g溶于250mL水中,在搅拌条件在下加入10%NaOH溶液150mL,用水稀释至500mL,即得。2.3对照品溶液配制精密称取橙皮苷标准品4.60mg,用甲醇溶解,并定容于10mL容量瓶中,配制成浓度为0.46mg/mL储备液,于4℃避光保存。分别精密吸取储备液适量,并稀释成系列浓度的对照品溶液,供分析用。精密称取明胶1.07g,用纯水溶解,超声15min,并定容于50mL量瓶中,配制成21.40mg/mL储备液,于4℃避光保存。供分析用。2.4制备最佳规划剂称取辨体调理膏组方药材银杏40g,山药24g,米仁40g,山楂50g,陈皮24g,红枣24g,用水浸泡20min,采用3因素3水平L9(34)正交实验法,因素和水平设计见表1,考察膏方药材的煎煮条件。在同一煎煮条件下,采用砂锅、陶瓷锅、不锈钢锅、考察膏方药材的煎煮容器。每组样品浓缩至800mL,真空包装成4小包,4℃冰箱中保存,供分析用。精密吸取上述过程制备的样品各2.5mL,用水稀释,摇匀,并定容至5.0mL,用0.45μm滤膜过滤,滤液作为供试品溶液。精密称取阿胶5.0g,分别采用水加热烊胶、黄酒加热烊胶、水溶微波烊胶3种方法进行烊胶,水和黄酒各加10.0mL,得到烊胶后的样品溶液。精密吸取样品溶液0.2mL,稀释50倍,取1.0mL,加双缩尿试剂4.0mL,混匀,常温下显色30min,554nm处检测,考察不同烊胶方法所致的阿胶蛋白质含量差异。精密称取龟甲胶8.0g,水和黄酒各加16.0mL,龟甲胶烊胶方式考察方法同阿胶。2.5方法的精密度、准确度和回收率采用优化后的液相色谱条件,进样分析一系列浓度(4.60×10-3～4.60×102μg/mL)的橙皮苷标准品溶液,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程y=38729x+59.711,相关系数R2=0.9995,线性良好。测定信噪比为3时的进样浓度即检测限(LOD),LOD为1.42×10-3μg/mL,测定信噪比为10时的进样浓度即定量限(LOQ),LOQ为4.60×10-3μg/mL,方法灵敏度高。配制浓度为72.00μg/mL橙皮苷标准品溶液6份,同一天内进样分析,计算日内精密度,RSD为2.41%,连续6日每日进样分析,计算日间精密度,RSD为4.06%,精密度良好。按供试品溶液制备方法,制备6份供试品溶液进样分析,以橙皮苷的浓度计算其RSD,来评估方法的重复性,RSD为3.60%;按供试品溶液制备方法,分别于0、2、6、12、24h进样分析,以橙皮苷浓度计算其RSD,结果为1.41%;按加样回收率测定方法,分别在已知含量的样品中,加入中浓度的橙皮苷标准品溶液,按照供试品溶液制备方法制备供试品6份,进样分析,计算加样回收率,RSD为3.72%,回收率为95.85%;以上结果证明该分析方法重现性、稳定性和准确度好。本法可适用于辨体调理膏制剂过程分析。2.6外标法进行的检测膏方药材煎煮条件的筛选采用3因素3水平正交实验法进行,9组实验液相分析结果见图1所示,并采用外标法测定了主要有效成分橙皮苷的含量,以橙皮苷含量为指标,进行方差分析,结果见表2。2.7液相分析结果选取目前常用的煎膏容器砂锅、陶瓷锅、不锈钢锅,在同一煎煮条件下进行实验,液相分析结果见图2所示,外标法测定3组样品中橙皮苷的含量,结果为C砂锅=175.48μg/mL,C陶瓷锅=115.69μg/mL,C不锈钢锅=41.47μg/mL。2.8种中小型胶的蛋白质含量采用水加热烊胶、黄酒加热烊胶、水溶微波烊胶3种方法分别烊化阿胶和龟甲胶,以明胶为对照品,紫外分光光谱法检测蛋白质含量,考察这3种烊胶方法对阿胶和龟甲胶中蛋白质含量的影响,结果见图3所示。3讨论3.1流动相梯度优化色谱条件优化过程中,对流动相溶剂(甲醇、乙腈)、流动相梯度、流动相酸度(0.01%、0.025%、0.05%、0.075%甲酸)、流速(0.8、1.0、1.2mL/min)进行了考察。结果发现,乙腈对化合物的洗脱能力强于甲醇,使得分析时间明显缩短,而且对橙皮苷的分离效果也比较好;在流动相梯度优化过程中采用了梯度洗脱的模式,并且在橙皮苷出峰前的一小段时间内采用有机相(B)比例为24%,水相(D)比例为76%的等度洗脱,使得橙皮苷色谱峰与其相邻色谱峰(柚皮苷)达到基线分离(见图4),充分保证了橙皮苷含量测定的准确性;随着流动相酸度增大,橙皮苷色谱峰的峰形得到改善,但是考虑到过高的酸度可能对色谱柱的使用寿命产生影响,所以选择甲酸的浓度为0.05%。3.2不同制备工艺对药材质量的影响从图1中可以看出,随着药材煎煮次数的增多,药材有效成分的煎出率显著提高,煎煮3次可使各种药材的有效成分充分提取出来,但是发现并不是煎煮时间越长,有效成分含量越高,因为有些成分可能随着煎煮时间的延长而分解,橙皮苷就是这类成分,表1中橙皮苷含量测定结果也证实了这一现象,以橙皮苷含量为指标的方差分析结果表明,煎煮时间对橙皮苷含量有显著性影响,而加水量和煎煮次数无显著性影响,此外,从图1中并不能发现加水量对药材煎出率的明显改变。考虑到煎煮次数的增加可使各类药材的有效成分充分提取出来,并结合生产实际,最终将药材煎煮条件确定为:煎煮时间30min,加水量8倍,煎煮次数3次。在该条件下进行辨体调理膏制剂的生产,既保证了膏方药材有效成分的煎出率,又能减少损失提高效率。3.3外标法测定橙皮苷的含量从图2中发现,使用砂锅煎煮膏方,可使膏方药材有效成分的煎出率显著提高,且明显高于陶瓷锅和不锈钢锅,外标法测定橙皮苷的含量结果显示,使用砂锅作为煎膏容器所得的橙皮苷含量是使用不锈钢锅为煎膏容器所得的橙皮苷含量的4倍,陶瓷锅也比不锈钢锅高出2倍,因此民间常用砂锅或陶瓷锅煎煮膏方,但现在也有不少病人出于便利采用不锈钢锅煎煮膏方,势必影响药材有效成分的含量,不能达到最佳的治疗目的,故建议病人采用砂锅煎煮膏方药材。3.4微波加热实验图3显示了不同烊胶方法对阿胶和龟甲胶中蛋白质含量的影响,黄酒加热烊胶所得到的蛋白质最多,水加热烊胶次之,而水溶微波烊胶得到的蛋白质最少,且明显少于前两者,可能是由于微波引起部分蛋白质的降解。虽然有不少病人出于便捷而使用微波炉来烊化阿胶等胶类药