不同助溶剂溶解阿苯达唑和阿苯达唑亚对细粒棘球绦虫幼虫作用的影响

不同助溶剂溶解阿苯达唑和阿苯达唑亚对细粒棘球绦虫幼虫作用的影响

currentgysh是一个广泛的疾病。这是由人类和一些动物寄生虫引起的严重人牛共患的疾病。它的流行在全世界几乎没有受到影响，已成为世界范围内的公共卫生问题。中国是受影响最大的国家之一。我国新疆地区囊型包虫病年发病率已达到42/10万。对包虫病的治疗,手术仍然是主要手段,但因手术并发症以及术后复发等问题,使包虫病的药物治疗逐渐受到重视。包虫病的药物治疗以苯并咪唑类药物中的阿苯达唑(ABZ)为首选,ABZ是一种脂溶性苯并咪唑类(BZD)广谱驱虫药物,广泛用于线虫、绦虫和吸虫等蠕虫病的治疗,但也同甲苯达唑一样存在肠道吸收差,肝脏浓度低等缺陷。因此,可通过增加抗包虫药物的溶解度和血药浓度,提高抗包虫药物的治疗效果。包根书等报道,同时使用两种助溶剂溶解药物体外干预细粒棘球绦虫原头蚴达到了很好的效果。为了增强ABZ体外抗包虫作用,本研究对常用助溶剂DMSO和吐温80的使用浓度进行优化,通过高效液相色谱法检测不同助溶剂以及单用、联用助溶剂助溶的ABZ溶解度,观察不同助溶剂溶解的ABZ和阿苯达唑亚砜(ABZSX)体外抗细粒棘球绦虫原头蚴及囊泡效果,阐明以联用助溶剂助溶对ABZ和ABZSX体外抗细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡作用的影响,为溶解性较好的ABZ和ABZSX药物剂型研制提供依据。材料和方法1材料表面1.1肝包囊的活性细粒棘球绦虫原头蚴取自新疆华凌屠宰场屠宰绵羊的肝包囊,原头节活性在90%以上。原头蚴体外培养2～3个月后形成,直径为1～3mm的囊泡。1.2细胞培养基和仪器DMSO,日本Biosharp公司生产;吐温80(药用级),湖南尔康制药有限公司生产,批号:20100801;胎牛血清,阿苯达唑,阿苯达唑亚砜,青、链霉素,RDMI1640细胞培养基,美国GIBCOinvitrogen公司生产;伊红,美国Amresco公司生产(批号:65BD32)。IKA-MS3digital涡旋震荡仪,德国IKA公司生产;KQ-200VDB型双频数控超声清洗器,昆山市超声仪器有限公司生产;BP211D型电子天平,德国Sartorius公司生产;二氧化碳恒温细胞培养箱,美国Thermo公司生产;DM1400B型倒置荧光显微镜,德国Leica公司生产;美国高效液相色谱仪,美国Waters公司生产。2方法2.1dmso混合液培养精密称取3份ABZ,分别置于10ml容量瓶内,分别加入浓度为0.1%吐温80溶液、1%DMSO溶液及0.1%吐温80和1%的DMSO混合溶液,置恒温培养振荡器中振摇24h,取出,于室温下静置。取上清液于离心管中,以9900r/min(离心半径9.8cm)离心15min,上清液用微孔滤膜滤过。取滤液,加入冰乙酸、甲醇定容,摇匀,用微孔滤膜滤过。取滤液,采用高效液相色谱法测定药物的溶解度。2.2不同药物干预zsx的原头和囊泡的测定细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡含20%胎牛血清(FBS)、1%青、链霉素的RDMI1640培养液中,于37℃、5%CO2条件下培养。分别用DMSO、吐温80和二者混合溶液溶解ABZ和ABZSX,使药物溶液达到过饱和,经0.22μm微孔滤膜滤过后备用。实验共设20组,原头蚴干预组和囊泡干预组各10组。即分别用DMSO、吐温80和二者的联合溶液溶解的ABZ和ABZSX干预的原头蚴和囊泡组,原头蚴和囊泡的助溶剂对照组,1%DMSO组、0.1%吐温80组,1%DMSO+0.1%吐温80溶液组以及空白对照组(原头蚴及囊泡)。原头蚴每组约3000个,置含25mlRDMI1640培养液的培养瓶中进行培养。囊泡每组约40个,置含50mlRPMI1640培养液的培养瓶中进行培养。将上述药物溶液分别加入原头蚴和囊泡的药物干预组培养液中,使培养液中的3种助溶剂浓度分别为1%、0.1%和1%+0.1%,药物浓度为以上浓度助溶剂溶解的饱和药物浓度。吐温80组加入占总溶液体积0.1%的吐温80,DMSO组中加入总溶液体积1%的DMSO,联用助溶剂组加入占总溶液体积1.1%的吐温80和1%的DMSO混合溶液,空白对照组加入相应体积的蒸馏水。每组设2个平行组。原头蚴组隔1d涂片观察1次:取各药物干预组培养液1ml,用0.1%伊红溶液染色3～5min,待原头蚴沉淀后涂片,倒置显微镜下观察计数,死亡原头蚴头节红染,伴有结构破坏且无活动性;活头节拒染不着色,且有活动性或分泌活动。每次每组计数原头蚴约200个,计算原头蚴死亡率,实验周期为10d。囊泡组每5d观察1次:取各组培养瓶在倒置显微镜下观察,记录该组全部囊泡的塌陷情况,实验周期20d。2.3统计分析应用SPSS17.0统计软件,计量资料比较采用配伍组试验方差齐性检验(F检验)和配伍组两两比较的q检验,α=0.05。结果1混合溶剂助溶剂abz溶解度结果见图1。以1%DMSO溶液、0.1%吐温80溶液及二者的混合溶液助溶剂ABZ溶解度分别为(0.79±0.003)μg/ml、(7.41±0.032)μg/ml和(22.45±0.144)μg/ml,差异有统计学意义(P<0.01)。2死亡率和原头死亡率3个溶剂组药物抗细粒棘球绦虫原头蚴效果见表1。经方差分析和配伍组两两比较的q检验,联用DMSO和吐温80药物组与DMSO和吐温80单用药物组原头蚴死亡率与4个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);联用DMSO和吐温80药物组与DMSO和吐温80药物单用组原头蚴死亡率比较,差异均有统计学意义(P<0.01);同种助溶剂溶解的两种药物组原头蚴死亡率,差异有统计学意义(P<0.01);不同助溶剂溶解的同种药物组原头蚴死亡率,差异有统计学意义(P<0.01);助溶剂对照组与空白对照组原头蚴死亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组随作用时间的延长,原头蚴死亡率逐渐增高。3各组小鼠囊泡法测定结果比较3个溶剂组药物抗细粒棘球绦虫囊泡效果见表2。经方差分析和配伍组两两比较的q检验,联用DMSO和吐温80药物组与DMSO和吐温80单用药物组囊泡塌陷率与4个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);联用DMSO和吐温80药物组与DMSO和吐温80单用药物组囊泡塌陷率比较,差异均有统计学意义(P<0.01);同种助溶剂溶解的两种药物组囊泡、完全塌陷率及总塌陷率,差异均有统计学意义(P<0.01);不同助溶剂溶解的同种药物组囊泡完全塌陷率及总塌陷率,差异均有统计学意义(P<0.01);助溶剂对照组囊泡塌陷率与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。各药物组随作用时间的延长,囊泡塌陷率逐渐增高。助溶剂的筛选ABZ是重要的抗包虫药物之一。ABZ进入机体后主要代谢成为ABZSX,并进一步代谢为阿苯达唑砜(ASON),ABZ的杀虫活性主要来源于ABZSX而ASON不具有杀虫活性。但是无论是ABZ还是ABZSX等苯并咪唑类药物肠道吸收均较差,血药浓度及生物利用度较低,能进入包虫囊壁和囊液中真正发挥作用的药物浓度只有血液中的十分之一到百分之一。因此在药物制剂中和体外实验时往往应用助溶剂来提高药物的溶解度。DMSO和吐温是常用于细胞培养体系以及原头蚴培养体系中的实验干预药物助溶有机化合物。DMSO常温下为无色、无臭、呈微苦味的透明液体,其热稳定性好,易溶于水、醇、醚、酯,能溶解除烷烃以外的各种极性有机物气体、液体或聚合物,与水、苯有较强的分子缔合作用,是一种强极性的惰性溶剂,被誉为万能溶剂。吐温80又称为聚山梨醇酯80,是一种非离子型表面活性剂,由于它具有较强的亲水性和在化学上的不解离性,对强电解质有显著的抵抗力,可用作乳化剂、分散剂、增溶剂或稳定剂等,并广泛用于药物、食品中。Stefan等报道,在体外实验中,单一助溶剂助溶的阿苯达唑、阿苯达唑亚砜以及二者与其他药物联合作用于包虫囊泡30d,仍然有部分囊泡以完整形式存在。为了增进苯并咪唑类药物的抗包虫效果,经过对助溶剂浓度的筛选,本研究在单用DMSO和吐温80溶解ABZ和ABZSX基础上,联用吐温80和DMSO溶解ABZ和ABZSX,观察两种药物体外抗原头蚴和囊泡作用,同时对比联用助溶剂与单用助溶剂溶解药物抗包虫作用的差异性。结果表明,联用助溶剂对ABZ的溶解效果远好于单用助溶剂,两种药物在体外均有明显的抗细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡作用。在药物相同时,联用助溶剂药物组对原头蚴和囊泡的作用优于DMSO药物组,DMSO药物组优于吐温80药物组(P<0.01);在相同助溶剂时,对原头蚴的作用ABZ优于ABZSX(P<0.01);对囊泡的作用ABZSX优于ABZ(P<0.01)。表明联合应用助溶剂助溶可显著提高ABZ和ABZSX的抗原头蚴和囊泡效果。有研究报道,改变药物的性状、体积以及制备脂质体、微球和纳米球等可提高难溶药物的溶解度,同时应用助溶剂及增溶剂也可在一定程度上增加难容药物的溶解度。而单一应用某些助溶剂对于难溶药物溶解度的提高不大。本研究联合使用D