聚蔗糖-复方泛影葡胺细胞的制备及漂浮密度的确定

聚蔗糖-复方泛影葡胺细胞的制备及漂浮密度的确定

杏仁中子细胞（pmn）是血液中特定神经系统中的第一个防细胞，约占总细胞总数的70%。血液中的分离是研究物理、统计学特性和功能的主要过程。PMN寿命较短,其合成能力有限,缺少修复能力,一旦被激活就产生一系列变化,最终被排斥、吞噬。PMN在血管中存活的时间平均只有6h～8h,分离的PMN在体外的存活时间更短,而且尚无理想的保存方法。用不同方法分离的PMN其存活时间及活性也有较大的差别,试验根据不同的研究目的,考虑到细胞纯度、获得量和活力等几方面因素,经过反复摸索,优化了3种适合于不同研究目的分离方法,当然这几种方法也有相互重复的环节。1材料和方法1.1材料表面1.1.1细胞剂和细胞剂右旋糖苷T-500,Percoll分离液,Ficoll-400,760g/L复方泛影葡胺,EDTA,Hanks平衡盐溶液,RPMI1640,小牛血清,400g/L的聚蔗糖。1.1.2实验动物长春市示范奶牛场健康、泌乳中期荷斯坦奶牛。1.2方法1.2.1浮力密度与浮力层的密度细胞分离液的配制:用400g/L的聚蔗糖液Ficoll-400以无菌双蒸水配成90g/L聚蔗糖溶液,此为A液,浮力密度为1.028;用760g/L复方泛影葡胺以无菌四蒸水配成340g/L的溶液,此为B液,浮力密度为1.198。根据公式D=(dAVA+dBVB)/(VA+VB),计算出A、B两液不同体积混合后的细胞分离液漂浮密度(表1)。取8支10mL硅化玻璃试管,编号(1～8),按密度从低到高的顺序分别加入细胞分离液4mL。取同一头奶牛的EDTA抗凝血2mL与等量Hanks液充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于上述试管的分离液面上,保持界面清晰。静置30min后,2000r/min离心20min。离心后管内分为4层,上层为血浆和Hanks液,下面相连依次是云雾细胞层、分离液层、实细胞层。对云雾细胞层和实细胞层分别镜检,确定细胞性质并找出云雾层细胞是PMN的试管,确定奶牛PMN细胞层与细胞分离液A液与B液的构成比例的关系。1.2.2percoll分离液体积比的确定将Percoll原液与87.7g/L的氯化钠溶液以9∶1(V/V)的比例混合,定为100%Percoll,再用灭菌生理盐水配制60%及75%的Percoll分离液(体积比),其中60%Percoll密度为1.079,75%Percoll密度为1.090。1.2.3细胞外包rpmi-1330①EDTA抗凝血,细胞计数,取2mL抗凝血,1500r/min水平离心15min。先吸取上层血浆,离心获得无血小板血浆(PPP)用以重悬粗提的白细胞。再吸取富含白细胞的“云雾细胞层”,放入另一试管,再加入2mLHanks液,混匀。②缓慢加于预置8mL75%Percoll液和1mLPPP的硅化试管(PPP在上层),注意保持两液界面的完整性。2000r/min水平离心20min。③取位于分离液界面上的白色层带,以吸管小心移入另一预置的4mL60%液Percoll的试管中,2000r/min水平离心20min。④弃去上清,加入3mLPBS洗涤细胞2次。然后用含100mL/L犊牛血清的RPMI-1640培养液调整所获细胞浓度为1×106个/mL。另取40μL稀释,涂片,瑞特氏染色、镜检。台酚蓝染色,细胞计数求PMN的回收率,并观察细胞的形态。1.2.4底层红细胞的制备①取EDTA抗凝血2mL,加入200μL的60g/LDextran,在37℃水浴中静置45min,使红细胞沉淀。②将上层白细胞加于预置的4mL60%Percoll的试管中(保持界面清晰),2000r/min水平离心20min,底层为PMN和少量的红细胞。③弃去上清,加入双蒸水1mL溶血30s,再加入2倍量PBS1mL,混匀,使PMN恢复等渗状态,1500r/min离心20min,用PBS洗2次,再以1.2.3的方法求PMN的回收率,并观察细胞的形态。1.2.5离心条件:1①取EDTA抗凝血2mL,加入8mL红细胞裂解液,混匀后静置3min。1500r/min水平离心20min。②弃去上清,加入2mLHank′s液,充分混匀后加于预置6mL60%Percoll试管的液面上,1500r/mim水平离心20min。③保留最底层的PMN层,以1.2.3的方法求PMN的回收率,并观察细胞的形态。2结果2.1牛血液中各种细胞成分的浮密度由表2可知,PMN的漂浮密度在1.080～1.085之间,淋巴细胞的漂浮密度在1.052～1.077之间。2.2percoll梯度离心法分离细胞的形态3种分离方法,在分离前后PMN形态改变均小于9%,其中Percoll梯度离心法所分离细胞的形态改变大于5%。分离后经纯化,涂片,视野中未见非目的细胞(图1和图2)。2.33回收率和活细胞率用Percoll梯度离心法、Dextran作用下的红细胞自然沉降法和裂解红细胞法对12头奶牛外周血样本进行分离实验,结果表明,PMN的回收率分别为92.17%±3.328%,90.28%±1.348%,88.79%±3.223%;进行多个相关样本的非参数检验,X2=8.667,说明统计量服从正态分布。P<0.05,说明3种分离方法差异显著;台盼蓝染色活细胞率大于97%,每种分离方法分别检查200个细胞,活细胞率分别是99.5%,98.5%,97%。PMN形态改变小于90%。细胞涂片未见血小板。3讨论3.1分离方法对牛奶pmn细胞回收率的影响国内外文献资料显示,分离人和动物PMN的方法众多,除本试验用到的方法外,如免疫磁珠、流式细胞仪等方法在很多实验室都有采用,但是为了服务于对PMN生化及免疫特性的研究,以何种方法,设计怎样的分离过程,才能有效地保护PMN的物理形态和生化特性,分离方法的选取就显得极为重要。本试验采用3种不同的方法分离奶牛PMN,其回收率差异显著(P<0.05),而活细胞率及细胞的形态于3种分离方法之间也无明显差异。从分离结果的统计分析表明,Percoll梯度离心法细胞的回收率略高于Dextran作用下的红细胞自然沉降法和裂解红细胞法,而后2种分离方法的细胞回收率相接近。这可能是由两种原因造成:①有一部分PMN随红细胞沉降;②红细胞裂解液对一些老化的PMN具有一定的破坏作用。此外也不可否认,在分离过程中丢失了一些细胞。3种分离方法中,以Percoll梯度离心法对PMN的物理形态改变最小,而红细胞裂解的方法细胞形态改变较其它两种方法大,这主要是因为红细胞裂解液不仅对红细胞膜有破坏作用,对PMN和其它外周血也有一定的破坏作用。3.2自身组织中分离的作用目前市售的细胞分离液主要有两种,即Ficoll(聚蔗糖)泛影葡胺和Percoll(硅石胶态悬浮液)。在此前的研究中,经反复摸索和比较,二者所分离的细胞纯度几乎无差别,但Ficoll法对PMN本身的影响较大,主要表现在:细胞形态改变,前者改变率为30.5%±15.8%,后者仅为3.8%±3.6%;趋化能力降低;暴露在相同剂量的LPS环境中释放超氧化物量降低等。Haslett等认为Ficoll结构中的长链烃组成具有LPS样作用,导致分离过程对PMN的激活。另外Ficoll泛影葡胺法中尚需用氯化铵溶解红细胞,所以溶解过程对PMN也具有损害作用。此研究仅使用Ficoll泛影葡胺法来确定奶牛外周血中各主要细胞的漂浮密度,主要是因为这种分离液配制简单,稳定性好,且大量使用时成本较低。采用Percoll作为PMN的分离液,因这Percoll的主要成份是硅石胶,对PMN的化学成份基本无影响。总之,应以不同的研究目的,选用不同的细胞分离液。3.3牛奶外周血pmn分离方法抽取外周静脉血时要注意无菌操作。操作全程应尽可能短时间内完成,以免增加死细胞数。离心机转速的增加和减少要均匀、平稳,使之保持清晰的界面。红细胞裂解要极时恢复其等渗状态。随着炎症反应综合征(Systemicinflammatoryreactionsyndrome,SIRS)概念的提出,对PMN在炎症过程中的作