肿瘤基因治疗基本方法

肿瘤基因治疗基本方法基因是一段染色体DNA序列，用于产生功能产物多肽或功能RNA分子。基因治疗一般是指将限定的遗传物质转入病人特定的靶细胞，以达到预防或治疗疾闰的目标的方法。肿瘤基因治疗是用正常或野生型基因矫正或置换致病基因或引入有治疗价植的其它来源基因的一种治疗方法。基因治疗一般是引入修饰基因于病人体内而并非该基因的产物，即是一种疗法而非新产品。但是，通过体内直接途径可将外湖DNA象传统的药物一样注射到机体内，帮、故有人称这些外源的DNA的基因药物。基因治疗中，从分子生物学角度可分为两种方式：一是基因矫正和转换，即将基因的异常序列进行矫正和置换，即将基因的异常序列进行矫正和精确的原位修复；二是基因添加和增补，即不去除异常基因，而是通过具有治疗意义的外源基因的定点整合，使其表达正常产物以补偿缺陷基因的功能。根据针对宿主病变细胞基因采取的措施不同，可分为基因置换、基因修正、基因转移和基因灭活四种方法。肿瘤基因治疗研究中，通常采用基因转移和基因灭活方法。基因转移是指将外源性目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物修饰缺陷细胞，使其恢复功能或使原有的功能得到加强，故又称为基因修饰。肿瘤基因修饰治疗研究包括免疫基因治疗、增强抑癌基因表达、靶向化疗或提高机体化疗耐受性等内容。基因灭活是应用反义技术特异性封闭某些基因的表达。反义技术是指利用针对特异性DNA和RNA片段按碱基配对的原则人工合成小分子核苷酸序列（反义寡苷酸），与其目的DNA和RNA序列互补结合，以选择性抑制目的基因翻译或转灵过程的技术和方法。在肿瘤基因灭活治疗中，订要是利用反义寡核苷酸抑制或封闭某些癌基因的表达。基因转移疗法一般分为两类：一是体细胞系基因转移，主要用于防治遗传性及非遗传性疾病；二是胚胎基因转移，用于预防遗传性疾病。临床上，基因治疗是指体细胞基因治疗。基因治疗基本上分为三步：①基因导入：是指把基因或含有基因的载体导入机体；②基因传递：是指基因从导入部位进入靶细胞核；③基因表达：是指细胞中治疗性基因产物的形成。1990年，Rosenberg等首次在晚期癌症病人中利用逆转录病毒载体基因转移技术，将转导了编码肿瘤坏死因子的肿瘤浸润淋巴细胞用于治疗晚期癌症。近10年来，随着人们对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的深入，肿瘤基因治疗获得了突飞猛进的发展，并逐渐走向成熟，批准进入临床试验的基因药物逐年增多。目前开展的免疫基因治疗、转导抑癌基因、反义癌基因以及靶向化疗等肿瘤基因治疗研究，其结果令人鼓舞。肿瘤基因治疗已成为目前攻克和治愈肿瘤最具希望的，也是最活跃的领域。1、肿瘤基因治疗的基本方法1.1确定基因治疗载体运载或携带治疗性遗传物质的工具称之为载体（Vector）。天然存在的载体可通过三种不同的机制在不同细胞之间转移：结合（和运动），转导和转染。转导依赖于整合入细胞基因组并经细胞分裂繁殖的病毒DNA分子。转染是DNA通过物理或化学的方法被动转运至细胞的过程。转导用载体通常是病毒，也是非病毒载体。基因治疗载体应具备以下条件：①易于进入细胞；②在特异细胞或组织达到有规律的、充分的及持续的外源基因表达；③外源基因应含有或整合于基因组活化区内或能自主复制的构件。④整个过程应安全有效并具有选择性；⑤易于大量生产。目前采用的载体还没有一种能具备上述所有的条件。理想的基因治疗载体除具备以上条件外，应该是静脉内传递并只转染特异细胞。目前常用基因治疗载体可分为病毒载体和非病毒载体两类。1.1.1病毒载体1.1.1.1逆转录病毒（RV）载体RV载体是经修饰的逆转录病毒，其复制所需要的基因被除去，代之以治疗性基因和选择性标记物。RV优点是能在体外条件下把基因高效转入增殖细胞，可同时感染大量细胞，有广泛的宿主范围，能稳定整合，插入基因的表达时间长等；缺点是RV的负载容量限于8kb,整合的随机性有潜在的危险性，基因导入原代人类细胞的效率低及靶细胞稳定转化后就难以逆转治疗等。在肿瘤基因治疗研究中，逆转录病毒载体介导法是应用最为广泛、有效的基因转移方法。1.1.1.2腺病毒（AV）载体重组腺病毒载体在基因转移中的应用相当广泛。AV优点是能感染非增殖细胞，不整合入机体细胞染色体，滴度高，免疫原性强等。缺点是容量小（4.5kb）,体仙表达时间短，使用次数受限制等。1.1.1.3痘苗病毒（VV）载体VV载体的优点是复制能力强，载体容易构建，容量大，可容纳25kv片段并且掺入基因的数量没有限制，免疫原性强，使用安全等。据点是病毒的强复制能力可能对处于免疫抑制状态的病人有害，偶尔也在健康个体致病等。1.1.1.4腺相关病毒（AAV）载体AAV是4.7kb单链DNA基因组的人类微小病毒。AAV载体的优点是：①AAV并不引起任何疾病，而在细胞培养及动物模型可表现抗肿瘤作用；②病毒本身只有两个基因，即复制基因rep和编码衣壳蛋白的基因cap,后者易于消除并可降低细胞毒性T』林巴细胞反应的危险性；③可在19号染色体上进行位点特异性整合，如果没有辅助病毒如腺病毒、疱疹病毒或水痘病毒等共感染，野生型AAV就潜伏在19号染色体上的特定部位，直到辅助因子出现才复制；④病毒DNA能够稳定有效地整合人细胞基因组；⑤有宽广的宿主范围，该载体似乎易感染造血干细胞，能潜伏感染非分裂期细胞；⑥AAV是一种可富聚的物理性质稳定的病毒体；⑦单链载体基因组存活于静态培养基，但经刺激后可分裂，然后可进行收获转导；⑧在动物模型中表达可持续半年以上。AAV载体也有一些局限性，如病毒小，最大插入痛列仅4.5kb，复制基因rep缺失的AaV与野生型AAV相比，载体整合效率较低、位点特异性较差。1.1.1.5单纯疱疹病毒（HSV）HSV-1是嗜神经性病毒，该载体可用于脑肿瘤基因治疗。其优点是容量大（40~45kb），能感染有丝分裂后细胞，能永久维持潜伏状态等。缺点是可能引起潜伏感染等。1.1.1.6其它病毒载体EB病毒（EBV）衍生的载体、猴病毒40（SV40）、人类巨细胞病毒（hCMV）、狂太病与假狂犬病病毒及基于HIV的载体等病毒载体都可用于基因治疗。1.1.2非病毒载体1.1.2.1脂质体(Liposime)脂质体是由磷脂和相似的两性脂形成的稳定的微囊。可分为带正电荷的或阳离子型脂质体和带负电荷的或pH敏感的脂质体两种类型。基因治疗用脂质体多为阳离子型脂质体，其优点有：①制备与使用方法简单；②可携带大片段DNA，乃至整个染色体；③可容纳疏水性及亲水性物质；④能与100%DNA形成复合物；⑤消除了危险重组于形成的可能性；⑥通用于各种类型的裸露DNA或RNA；⑦能转染各种类型的细胞，转染率较高；⑧没有免疫原性。阳离子型脂质体已成为商业化产品。1.1.2.2配体-多聚赖氨酸-DNA复合物(Polyplex)Polyplex是有效的转染制剂，其活性发挥并不需要脂质体的参与。阳离子聚胺(Polymine)是该制剂的重要成分，并与阴离子DNA形成复合物。另一种制剂多聚-L-赖氨酸的优点是不同的配体与碱性氨基酸基团耦联。多聚乙烯亚氨(PEL)是具有最高阳电荷密度的有机大分子，是基因治疗的高度有效载体。可用以进行体内外寡苷酸和质粒的传递。此外，各种脂精氨(Lipospermine)显示了较高的基因转移水平。树突三聚体(Dendrimer)树突三聚体作为基因转移载体的优点有：①可形成精确的大分子结构；②构件极其微小；③没有免疫原性。受体介导的内吞作用受体介异载体也称为分子交连载体。其原理是DNA连接到靶向分子如多聚赖氨酸，交连的DNA复合体再结合到特异的细胞表面受体，通过内吞作用将DNA转入细胞。其他非病毒载体合成的肽复合物、人工(合成)病毒载体及人工染色体等非病毒载体在基因治疗的应用在不断研究和完善中。1.2确定基因治疗的靶器官、组织、细胞及目的的基因1.2.1基因治疗的靶器官及组织基因转入某一组织，可能对有这一组织的器官的疾病有治疗意义，也可能对超出靶组织的器官疾病有治疗作用。已涉及基因治疗的靶器官及组织见表15-1。1.2.2基因治疗的靶细胞基因治疗靶细胞(Targetcell)或称受体细胞(Recipientcell)一般要求符合下列基本条件：①来源容易；②蝗在体外培养和扩增；③易于被基因转染并进行高效表达；④易于体内移植或回输，用于人体后所携带的目的基因能稳定地表达；⑤具有比较长的生存寿命。目前用于基因治疗的受体细胞有淋巴细胞类、肿瘤细胞、造血干细胞、肌细胞、皮肤或纤维细胞等。表15-1基因治疗的靶器官/组织及其优势组织 优点骨髓容易获得：可在体外培养；易返回机体上皮细胞使用腺病毒可在体内将基因转入呼呼上皮。经内窥镜接近肠上皮进行体细胞基因疗法皮肤最容易大面积接近的组织；干细胞可使表面持续更新；皮肤中转基因表达可影响全身血管内皮外源性遗传物质可转入血管组织内皮细胞间皮间皮覆盖了体腔内表面，由单层细胞组成肌肉裸露质粒DNA可注射转入骨骼肌或心肌。基因转入骨骼肌后可在体内持续表达并释放治疗性蛋白质神经基因导入脑循环；基因导入脑脊液；CNS间接打靶技术肝脏肝脏疾病的基因疗法的重要靶器官胰腺基因转入胰腺为治疗胰腺癌等提供了可能眼组织眼组织内注射可作为基因治疗的靶1.2.2.1免疫细胞外周血淋巴细胞是恶性肿瘤、获得性及遗传性免疫系统紊乱性徉病的基因治疗的主要靶细胞。主要以T淋巴细胞为主。肿瘤侵润性淋巴细胞（TLL）、肿瘤引流淋巴结（TDLN）细胞、巨噬细胞等作为受体细胞很受关注。成纤维细胞成纤维细胞位于全身并具有较强的自我更新能力。在各种基因转移技术中可采用成纤维细胞作为靶细胞。优点有：①易于获得；②容易体外培养和扩增；③分裂中的成纤维细胞易与逆转录病毒一起稳定转导，并能较稳定的表面外源目的的基因；④携带外源基因后能稳定地回植体内并进行表达；⑤回植的成纤维细胞容易取出，等。主要缺点是在体内由于细胞凋亡而引起的基因表达失活。骨骼肌细胞遗传工程化的成肌细胞可能是体内传递重组蛋白较好的系统。其优点有易于获得及在体个可大量扩增，可用于治疗累及肌肉的遗传病及一旦插入分泌性基因可使基因产物直接分泌进入血流等。由于肌源性前体细胞的存在与稳定性，故有学者认为骨骼肌细胞是基因治疗的理想靶细胞。血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞易于获得、培养和移植，故是基因治疗常用的靶细胞。肿瘤细胞癌细胞是肿瘤基因治疗的主要靶细胞之一。可采用原代肿瘤细胞或HLA配型的肿瘤细胞株。通过构建肿瘤细胞特异性定向高表达病毒载体使肿瘤细胞作为受体细胞更具有优越性。造血干细胞造血干细胞是基因治疗遗传病、自身免疫性疾病及癌症常用的靶细胞。在肿瘤基因治疗中，造血干细胞是耐药基因、细胞因子基因等较理想的受体细胞。其他肝细胞存活期长，又在机体代谢中有重要作用，因而是肝癌等肿瘤基因治疗的受体细胞。另外，角质细胞、神经胶质细胞、上皮细胞等也各有其特点而被用于肿瘤基因治疗的受体。1.2.3肿瘤基因治疗的目的的基因肿瘤基因治职的目的基因主要包括细胞因子基因、MHC分子基因、协同刺激分子基因、抗癌基因、反义核酸、肿瘤的药物相关基因及病毒基因等。肿瘤基因治疗的目的及常用目的基因简介如下。1.2.3.4能改变肿瘤细胞的恶性表型的基因肿瘤细胞主要有癌基因的突变、扩增、过度表达，对此可采用反义核酸或核酶；抑癌基因的突变、失活等，可采用野生型的正常基因作为治疗基因，用正常基因剔除或替换缺陷基因。1.2.3.2能提高肿瘤细胞的免疫原性的基因向肿瘤细胞转导参与细胞免疫的细胞因子（如IL-2、GM-CSF）基因，共刺激分子B7基因等，以增强宿主的抗癌免疫反应，可统称为免疫基因治疗。肿瘤药物增敏基因肿瘤药物敏感基因治疗是将编码某一敏感性因子的基因转入肿瘤细胞，使肿瘤细胞对某种原本无毒或低毒的药物产生特异的敏感性而死亡。这一表达敏感性因子的基因也被称为自杀基因（Suicidegene）。常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因、水痘-带状疱疹病毒苷激酶（VZV-TK）基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因、黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶（XGPRT）基因、嘌吟核苷磷酸化酶CPNT）基因、细胞色素氧化酶P450基因、胞苷激酶（dck）等。如向肿瘤细胞转导HSK-TK基因、，该基因能将无细胞毒性的原药丙氧鸟苷（GCV）磷酸化，对细胞产生毒性作用；向肿瘤细胞转导CD基因，能将无毒的前药5-氟尿嘧啶（5-FU）转化成有细胞毒性的5-氟尿嘧啶。自杀基因多是由病毒载体转移进入细胞，故该方法又称为病毒导向的酶前药疗法（VDEPT）。耐药基因耐药基因治疗的目的是提高造血细胞等对化疗药物的耐受性。目前研究的耐药基因有多药耐药基因（MDRL）、二氢叶酸脱氨酶（DHFR）等。如向造血干细胞转导耐药基因MDRL，防止化疗药物的骨髓抑制作用。1.3基因转移技术基因转移至病人可以离体转移（exvivo）后再回输给病人，即回体基因治疗：还可采用体内直接注射途径。回体基因治疗一般应用病毒载体，由于该法比体内法更有效，故在临床试验中较常使用。回体基因治疗的缺点是在把细胞植入机体之前，可能发生细胞的遗传性改变；值人生长的培养基中的遗传工程细胞时，大部分在体内不能长期生存等。体内基因治疗是直接把遗传物质导入人体，这可以用非病毒载体完成。体内基因转移可以是局部（原位的）或者是全身性转移，其中原位基因转移（Insitugenetherapy）指将遗传物质直接导入人体局部区域；全身性基因转移时，基因传递的部位可能与某种形式的靶位无关，只要治疗分子最终到达作用部位。体内基因治疗的优点是：①不需要特殊细胞培养设施；②在控制条件下，大量制备临床用质粒DNA要比制备病毒载体容易;③没有回体基因治疗可能造成的致病性，一般较为完全等。体内基因治疗的缺点是由于难以接近靶组织，故转移效率较低，注入的DNA的稳定整合的水平也较低，等。体内直接途径的基因治疗是指不需要细胞移植而直接将外源DNA注射至机体内，DNA可单独注射，也可以与畏助物如脂质体一起注射，使其在体内转录，表达而发挥作用。体内直接途径比exvivo或invitro的基因治疗方式简单、直接、经济、疗效也比较确切。下面对各种基因转移技术作以简要介绍。1.3.1回体法基因转移技术1.3.1.1化学法常用钙磷酸盐转染法：先将质粒DNA与氯化钙溶液混合，然后再加入磷酸盐缓冲液。该技术取决于通过与钙粒子相互作用形成的质粒DNA的沉淀，其转移效率通常很低（小于1%），转染之后几乎难以在体内观察到转移基因的表达。极低的细胞毒性及简单便宜是该法的优点。1.3.1.2物理法（1）电穿孔法：电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口吧便把大分子如dna导入细胞的技术。一旦dna扩散进入细胞，就立即终止作用，这时细胞膜上的小孔又可自动重新闭合。该法具有可重复、干净、快速及相对没有毒性等优点，但存在基因转移的效果较差等缺点。（2） 基因枪：基因枪技术也称颗粒轰击法或生物子弹微射法，基因枪可直接轰击包被金属颗粒的dna，把携带有治疗性kna的颗粒直接射入靶组织或单个靶细胞。该法具有简单、快速、可重复、基因传递谱广泛、不受基因大小及数量限制等优点。其缺点是进入内脏器官受限、基因转入细胞核的效果差、洲入的dna稳定整合的水平较低等。（3） 显微注射法：显微注射法是在显微镜下人工用带细针的注射器穿透细胞膜并把遗传物质注入细胞质的方法。该法用于胚素基因转移。（4） 超声波介导的转染：超声波增加细胞膜的通盘性并使质粒被动扩散进入细胞变得容易。该法是把外源性dna及其他大分子导入细胞的较有前景的方法。细胞介导的基因治疗细胞在体外扩增、修饰后，注入机体靶组织。常用的介导基因治疗的细胞有成纤维细胞、骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、淋巴细胞、肝细胞、神经元细胞等。囊包细胞植入囊包技术涉及用选择性通透膜包囊细胞，植入宿主体内特定部位。靶向基因治疗将基因转运到特定的靶细胞是提高基因治疗效果和减少不良反应的重要措施。常用靶向基因治疗转移技术见表15-2。1.3.2体内基因治疗的基因转移技术体内基因治疗的载体可以是病毒载体，也可