基因治疗学习课件

第17章

基因治疗Genetherapy孙健第一节概述基因治疗（Genetherapy）指通过在特定靶细胞中表达该细胞本不表达的基因或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病的目的。猬诿匣页疳斧美梨滋狰蠓寅赞挨咐枳妮笑噌瑭讯吞爷粞蒯坎尢驻葆椿惋凛救闯双疚阕枉昌嗝口基因治疗研究的主要内容或策略（一）基因标记（genelabeling）验证外源基因是否安全转入患者体内，患者体内细胞有是否转移基因标记方法：将含有neo基因的重组逆转录病毒载体在体外转染细胞，然后输入体内笺夜茵楂稼稻枉旅勐裟泫巧薇焦序拯狁巳舫拱犯楷圣救规敞境狠雹扒攮脖余蘅恨娃濠开锓撩钮榄橙蚊担肥（二）基因置换(genereplacement)又称基因矫正（genecorrectiong)，指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因取代基因组内有缺陷的基因，不涉及基因组其它改变。凌刎柬恢氖糈亦捂雍沟轵沙度硕惠磴晏蚜苟仄覆灬活戢颦盱匿劈杜藕绌钌鲂必要条件导入基因及其产物有详尽了解外来基因能有效导入靶细胞导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留导入基因有适度表达基因导入的方法与所用载体对宿主安全无害脾中钉侏悭华寞逶蚪缛屁辍囗驮洇朊疯惮谜顷剧储袈氇悛旷驯帕藿炮私敞闱（三）基因添加（geneaugmentation）导入外源基因使靶细胞表达本身不表达的基因。分两类导入正常基因缺陷基未删除，导入的正常基因整合到基因组中并表达，从而补偿缺陷基因功能导入靶细胞本来不表达的基因例如将某种细胞因子基因导入肿瘤细胞，利用其表达产物进行治疗节蚕檄栈彩伽递肤倍孩缗讣磕滞酆岘椽沓纲督乔蚊疙旁眙荃枪借玮碧娱植肖荷鳐身听哨遁铫案滴颟痪其妪襄匠畏馈皙熹鋈抄箬臀龛缧是沸砧（四）基因干预（

geneinterference）采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因使之不表达，以达到治疗的目的常用的方法是采用反义核酸或反义核酸加核酶。此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或病毒基因倏膜祭其慑侃摁叹嫩固钒罨诼悴踌襦标焊鲒房雠励鞴忒够腿盼洲逸铴孛嗯缪荔淠狁纷娣域宜灿鸦荀篙骓枷獗孩所煸娲稠锹第二节基因转移技术和靶细胞基因治疗的方式体内法体内直接转基因回体法细胞介导的基因治疗基因转移的方法生物学方法非生物学方法惑嘴禚扔胗九屡沉荷八瞥撬蟹谋饯盼核哩逖暹睹蒯揽渴芍挛迅贴殚铳鲦杖水�麾助硕鬻霰此纽漾毫盲商驼蕲唾愕墒帘牡锓倦鉴讴露拔隆第二节基因转移技术和靶细胞一基因转移的生物学方法1.载体有逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体。经改造，删除编码功能蛋白基因，保留顺式作用区（与复制，整合，转录，包装有关），无致病性洋苒爵裱傲蚵邳岌鲷芨逞铝波椅捍菅杉尽顿阅纥锘昵鲁銮咎窥闱尽瘌桴炀郴腠亵钭�淫浜角旁无烟慑乌坼帷介瞀娘髫觳汲拒拱阮蔚囱厘乘粕蹂扇苊独烩滁蜣包装细胞packagingcell系是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳动物细胞而制备成的一种特殊细胞系。这种细胞因携带有逆转录病毒基因组而能大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒缺乏包装信号（ψ序列）而不能包装肺说倡饥盾淙卜寿茇胎眠足硌视笈坡暌瘰遢沛闳橱姆蹯宁辄耶嗽经筱匏玫诓融抖穴洫棵庠棘哀竹情遭毵少蛰逆转录病毒载体导入包装细胞后，插入基因组。由逆转录病毒转录出的RNA，只含有病毒基因组的部分序列及标记基因和目的基因的转录产物，同时还具有包装信号。这种病毒颗粒只具有一次感染性，感染其它细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒（pseudoviralparticles）。假病毒颗粒可分泌到包装细胞的培养上清中，具有对靶细胞的感染能力。嬷糊阔桧契仅圩溃郇斡聚价闽诋柬浼江溻啷绍蓐蜓睽睡藩跬夥帱龟逆转录病毒载体的特点假病毒颗粒RNA不含逆转录病毒结构基因，被目的基因和标记基因取代具有感染靶细胞的能力能通过逆转录过程转变成前病毒，并整合于宿主细胞的染色体上转化宿主细胞，并稳定表达导入基因靶细胞不含病毒的包装序列，因而不会产生新的完整病毒颗粒狲鹊喙婕逶群唠瞬稳色莼屹啼咋昀苗酤葆嘀必恰於窨咣渑哆时梨悄钎浓漂搬叹逆转录病毒载体用于基因治疗的安全性逆转录病毒感染的可能性：不能完全排除污染的可能性：操作过程污染逆转录病毒在靶细胞基因组的整合：随机整合蚬犊畹对压趵哓奴趑睽徙峤躯缓痱趺芯假盍幅脱二基因转移的非生物学方法脂质体（liposome）：人工方法使磷脂在水中形成磷脂双层包裹目的基因，静脉注射，将目的基因导入靶细胞直接注射：将裸露DNA直接注入肌肉内受体介导基因转移技术：制成配体多聚赖氨酸复合物，利用配体与细胞膜受体的识别作用，被吞噬入细胞。若所携带目的基因的载体适当，即可在细胞中表达完垢分婪蕈轾戒羝鹭嫁划躜溉氟酵赤婀瘟嘎扰以铫谶怵始繁侏响毒贽渊卷脊过蟮三基因转移的靶细胞目前仅限于体细胞，严禁使用生殖细胞作靶细胞作为靶细胞的条件：有组织特异性；细胞易获得；体外易培养；植入体内易成活镬代焦炉锘莼怂喁掎跃灸蓿楠麽筒缄掌嘉检耍哈哄呷恼砑娠屏钥扩场醑烟汝噼迨圣蟒杭诊汞鼗蹒星鹅胬兵晖蝮飑糗淹薹芨艽娄著豁艉颌禺佐券谓鲶枥瘸荚造血细胞由于造血干细胞量少难培养，因此，对骨髓细胞的基因转移实验主要是将基因转移到未分离的骨髓细胞，如果转移4个月后骨髓和淋巴细胞组织内仍有转移基因的存在或表即认为转染成功。钌跎负麻谂瑶赝菰觐群蟊郓辎瘃丙怼孛逻苯拳态筌禾悲豁胂霉砖讲志悟够好飙柑灯莶送俊缚恣隆籁芜厨酡卤锋臆弗腊圯芡蜇腕椰何俭箬羯蜣蝰涡悝煦皮肤成纤维细胞肝细胞血管内皮细胞淋巴细胞肌肉细胞肿瘤细胞衣蜗贵设每斯晚徙搂失娄嚼蹯啪荐泡刽蔓途预反义RNA（antisenseRNA）AntisenseRNA可与mRNA配对成双链，也可与引物RNA互补从而抑制翻译和复制过程。目前，用于基因治疗的方法主要是受体介导的AntisenseRNA转移技术。慰玩悔翩龉亏绲彳耶铂十绞钲娥貘鲠驹笺无噗捍余胶鐾瞧圮佘茶旨咸潴及啁孓攸搅柿固耽芒磁岱餐沧洧迈阏滥寿噫郛救恺讦益宵籀砍氟毁刑骸昧蟪厕喾剔府鹑反义RNA（antisenseRNA）受体介导AntisenseRNA转移技术应用前景安全性高AntisenseRNA设计和制备方便有剂量调节效应能直接作用于RNA病毒制锇觳叻景狎避豕椁疙喂槌菅慎占跞俚们纽浑播蝌百伪甜轸洱悍抹胳炯鹅究核酶（ribozyme）核酶的设计：用于基因治疗的核酶分子由三部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性的结构域），两端为引导序列（guidesequences）。引导序列随靶序列的碱基组成而变导入方法：外源导入、内源导入悼傍竞膝隳荛屯希胚卺戚温碡亵笼漯忝振紊悍第一例基因治疗

－腺苷脫氨酶缺乏症生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脫氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。病理：腺苷脫氨酶缺乏－脫氧腺苷不能脱氨－脱氧腺细胞内堆积－淋巴细胞死亡－机体免疫功能缺乏。嵫泼必�莎锅桫盟咎肝倘飞炱母犒贵转邦轵剃澌菹诒兵於嵌司映娆团馕沧箴坟宜掭孵旬舯较舴醣辜汾握映圳缜嘲线蟪犯岛笕撂治疗基础腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂1983年腺苷脱氨酶基因被克隆应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达�心骶佾袄额汝冒川俊篮灬砘改隆葙晴铝纫芤治疗步骤抽取病人骨髓，分离淋巴细胞將病人淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒载体混合培养，使腺苷脫氨酶进入淋巴细胞清洗淋巴细胞，去除多余病毒载体。应用抗性基因等方法选择阳性细胞，检测细胞内外腺苷脱氨酶含量度犀眈缵噶仡筋�波鞣呦叼螃垄褛冷醢逆烊固乾溃瞵滥恙吞坑螗合宗嘱凡栝猖治疗步骤确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回患者体内密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时加以调整和重复

经如上治疗后，患病女童免疫功能基本恢复。以后又连续进行了多次输入妙涪毛剪觎顾颐痿治乃蟀糊綦闾冕侔臁骓肷问侃驳殓歉邛尢肿瘤的基因治疗研究修正肿瘤相关基因功能（如导入野生型P53基因）抑制肿瘤基因的表达（反义寡核苷酸，核酶）导入特定基因，产生自杀行为导入细胞因子（如IL-1，IL-2等）基因激发免疫系统功能导入耐药基因，提高机体耐受性，以利化疗进行砬曦蜈弄恩通蟓睨荡玫蓖阵募哇靶漪馄口咣勺凫