雌激素对绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞op-hbmscsich信号通路的影响

雌激素对绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞op-hbmscsich信号通路的影响

骨质疏松症是一种以骨量少为特征的系统性疾病，骨的微观结构破坏，骨的脆弱增加，容易发生骨折。骨质疏松症的发病机制仍不明确。雌激素缺乏是绝经后妇女骨质疏松症发生的重要原因。相关研究表明,给予雌激素替代疗法的绝经后妇女,发生因骨质疏松症导致的骨折概率明显下降。骨质疏松症患者骨髓中脂肪细胞和松质骨的骨量呈反比,骨质疏松症可能是骨髓间充质干细胞分化失衡后过多向脂肪细胞分化所致。前期研究表明,雌激素可以通过雌激素受体α或者激活Wnt/β-Catenin信号通路改善人骨髓间充质干细胞成骨分化的能力。尽管如此,雌激素治疗绝经后骨质疏松症以及调节骨髓间充质干细胞成骨分化的相关机制仍然不详。Notch信号通路在细胞分化潜能、细胞自我更新能力以及凋亡过程中是一个高度保守的信号通路。目前对于雌激素与Notch信号通路的研究主要集中在人类肿瘤以及大脑发育的研究。人骨髓间充质干细胞的分化过程中,雌激素是否仍然通过影响Notch信号通路对分化及增殖产生影响的研究相对缺乏。本研究通过观察Notch信号通路在人骨髓间充质干细胞增殖及分化过程以及在绝经后骨质疏松症发病过程中的作用,以期进一步探讨雌激素调控人骨髓间充质干细胞功能的具体机制。材料和方法知情同意书的签署本研究经第四军医大学伦理委员会批准(批准号:20110405-5),所有受试者(无感染性疾病、无血液系统疾病的健康志愿者和绝经后骨质疏松骨折患者)均签署知情同意书。患者骨髓来源无菌收集术中切除的椎骨骨髓;骨髓穿刺获得的髂骨内骨髓;长骨骨干骨折时干骺端的红骨髓;髋关节置换术扩髓时的红骨髓;髂骨移植手术时,患者髂骨松质骨内骨髓。本实验所用骨髓分别来自4名健康女性骨髓穿刺的髂骨内骨髓(年龄<35岁)和4名患有绝经后骨质疏松症并发生股骨颈骨折行髋关节置换术时所取的髂骨内骨髓(年龄>75岁)。纳入标准:根据世界卫生组织(WHO)的诊断标准:绝经后骨质疏松症患者标准:>65岁,T值<-2.5SD,血清钙、磷、碱性磷酸酶,Ⅰ型胶原羧基末端肽,尿中钙排泄率等检查指标排除继发性骨质疏松症。健康女性标准:<35岁,T值>-2SD,无骨折史。排除可能存在的骨代谢疾病,无服用可能影响骨骼或钙磷代谢的药物史。试剂与pcrFicoll细胞分离液、DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素、β-甘油磷酸钠、地塞米松、L-抗坏血酸、吲哚美辛、IBMX、胰岛素、雌激素均购自美国Sigma公司;BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自上海碧云天生物公司;RNA提取试剂盒购自美国Omega公司;SYBRue5f8PrimeScriptTMRT-PCRKit购自日本Takara公司;iQ5RealTimePCRDetectionSystem为美国Bio-Rad公司;基因引物由上海生工生物公司合成。细胞培养液lm-2m采用密度梯度离心法进行人骨髓间充质干细胞的分离。步骤如下:用20mL注射器吸取5~10mL髂骨松质骨骨髓,用0.5mL稀释的2500U/mL肝素钠清洗注射器。将无菌肝素化骨髓5~10mL与等体积培养基于离心管内充分混合,1000r/min离心5min。离心结束可见试管内混合物分为3层,从上至下分别为脂肪层、血清层及血液沉积层。用吸管吸取脂肪层和血清层,将血液沉积层吸出后贴壁缓慢注入已预置等体积Ficoll细胞分离液的试管内,使两者间形成清晰界面,2500r/min离心25min。用滴管抽出中间乳白色云雾状单核细胞层,置于无菌离心管内,用PBS缓冲液充分漂洗(800r/min离心5min)3次,弃上清。重悬于加入含10%FBS及100U/mL青链霉素的DMEM-低糖培养液中,以6×103/cm2细胞密度接种于25cm2培养基。静止置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中,3d后全量换液,弃未贴壁细胞,以后每3d全量换液一次。待细胞汇合成单层后加入0.25%胰酶消化,按照1∶2比例进行传代接种培养(第一代,P1),待培养到P3代用于后续实验。免疫组织化学法检测细胞抗体检测取第3代生长良好原代人骨髓间充质干细胞,用胰酶消化后,用PBS冲洗,离心。将细胞在离心管中重悬于100μLPBS中,每个离心管细胞数为106个。将细胞分为以下5组:空白对照组;1μLCD34-FITC组;CD44-FITC组;CD45-FITC组;CD105-鼠抗人异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)进行抗体染色组。将上述各组细胞4℃放置30min,用PBS冲洗一遍,离心,弃上清,加入1mLPBS重悬细胞行流式细胞分析。细胞分离、制备分别取健康女性与绝经后骨质疏松妇女P3骨髓间充质干细胞,用0.25%胰酶常规消化细胞,离心收集细胞沉淀,重悬细胞,以104个/孔接种于96孔板中,隔日换液。在第1、2、3、4、5、6和7天取出96孔板,每孔加入MTT20μL,37℃孵育4h后,弃孔内上清,每孔加入100μLDMSO,室温下震荡10min,使结晶完全溶解。在酶联免疫分析仪上,选择波长490nm测定吸光度值。细胞常规培养取绝经后骨质疏松症患者P3细胞,用0.25%胰酶常规消化细胞,离心收集细胞沉淀,重悬细胞,并以105个/孔的细胞密度接种于6孔板进行常规培养。隔日观察细胞,待细胞生长融合至30%,将细胞置以下2种培养基:正常对照组(A),雌激素共培养组(17β-Estradiol,10-7mol/L)(B)。隔日更换相关培养基。培养7d后检测Notch信号通路关键分子表达情况。细胞密度接种取P3细胞1瓶,用0.25%胰酶常规消化细胞,离心收集细胞沉淀,重悬细胞,并以105个/孔的细胞密度接种于6孔板进行常规培养。隔日观察细胞,待细胞生长融合至60%,用成骨诱导培养基(地塞米松100nmol/L、L-抗坏血酸50mmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L)替代正常培养基,进行成骨诱导。细胞密度接种取P3细胞1瓶,用0.25%胰酶常规消化细胞,离心收集细胞沉淀,重悬细胞,并以105个/孔的细胞密度接种于6孔板进行常规培养。隔日观察细胞,待细胞生长融合至60%,用成脂诱导培养基(吲哚美辛200μmol/L、IBMX0.05mmol/L、胰岛素10μg、地塞米松1μmol/L)替代正常的培养基,进行成脂诱导。碱性磷酸酯酶显色法细胞成骨诱导7d后,PBS冲洗3遍,4℃多聚甲醛固定30min,PBS洗3遍,每次5min,用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒进行碱性磷酸酶显色。按试剂盒说明书配制染色液。PBS洗后,加入适量已配制好的BCIP/NBT染色液,以刚好可以铺盖细胞表面为准。37℃避光保存30min。去除BCIP/NBT染色液,用PBS清洗3遍终止染色,拍照观察。细胞表面铺盖细胞成脂诱导10d后,PBS冲洗3遍,4℃多聚甲醛固定30min,PBS再洗3遍,每次5min。按照油红∶去离子水=3∶2的比例稀释油红储存液,滤纸过滤,室温放置10min。将稀释好的油红染色液加入培养板,以刚好可以铺盖细胞表面为准。室温保存15min后,用蒸馏水清洗3遍终止消化,显微镜下观察并拍照。-ctrt-pcr方法的开发采用SYBRGreenⅠ进行相对定量分析基因表达,实验按照2-ΔΔCt解析法进行设计,引物由上海生工生物工程公司合成,引物见表1,实时定量PCR反应体系见表2,实时定量PCR反应程序见表3,采用2-ΔΔCt值法对于RT-PCR结果进行分析。anoa分析采用SPSS17.0统计学分析软件进行ANOVA分析。采用独立样本t检验,数据用ue0af±s表示,P<0.05表示差异有统计学意义。结果胞型成纤维细胞形态采用密度梯度离心法分别培养健康女性及绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞。可见健康女性骨髓间充质干细胞为典型成纤维细胞形态,呈纺锤形,细胞密度较大,呈集落样生长,边缘清楚。而绝经后骨质疏松组来源的骨髓间充质干细胞形态宽大扁平,呈单个样生长,形态不规则,分散生长,细胞数量少(图1)。MTT结果显示绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞增殖能力较低(P<0.01)(图2)。alp染色及油红o染色的诱导成骨、成脂方向分化将第3代骨髓间充质干细胞成骨诱导7d、成脂诱导10d后分别进行ALP染色及油红O染色,发现其诱导成骨、成脂方向分化(图3)。流式细胞术鉴定根据骨髓间充质干细胞表面标记分子表达分别为CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD105(+)的特征,采用流式细胞仪进行分子表型鉴定的结果表明,培养细胞骨髓间充质干细胞CD44、CD105阳性率>95%;CD34、CD45阳性率<5%(图4)。两组etch信号通路关键分子表达水平比较绝经后骨质疏松患者hBMSCs中Notch信号通路关键分子表达水平较正常组降低,差异有统计学意义(P<0.01,n=4)(图5)。治疗骨髓间充质干细胞中etp信号通路活性的变化对绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞给予雌激素刺激,与未给与雌激素刺激的绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞相比,发现前者Notch信号通路活性增加(图6)。即雌激素可升高绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中减弱的Notch信号通路活性。髓间充质干细胞分化前后etch信号通路活性的变化在骨髓间充质干细胞处于未分化状态时,雌激素可提高Notch信号通路活性。在骨髓间充质干细胞分化的关键时间点(3、7、14d),在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化以及成脂分化成熟的过程中,雌激素刺激组与未给与雌激素刺激组相比,发现Notch信号通路活性均增高(图7、8)。激素对小鼠血清中酸性磷酸酶的影响将绝经后骨髓间充质干细胞与雌激素共培养,在成骨诱导7d时进行碱性磷酸酶染色,可见雌激素刺激组碱性磷酸酶染色较深,碱性磷酸酶密度较大;成脂诱导第8天进行油红O染色,可见雌激素刺激组脂滴染色较浅,密度较低。根据以上结果表明雌激素可促进绝经后骨髓间充质干细胞成骨分化,但抑制成脂分化(图9)。引导人骨髓间充质干细胞激活作用骨髓间充质干细胞具有多向分化的能力,通过成骨诱导和成脂诱导及ALP和油红O染色均可证明其分化潜能。本研究根据骨髓间充质干细胞表面表达黏附分子CD44和CD105,不表达存在于造血干细胞前体的CD34和CD45的特性,采用流式细胞仪对分离细胞进行鉴定,证实可培养出纯度较高的人骨髓间充质干细胞。Notch1信号通路在人骨髓间充质干细胞分化为神经元细胞中发挥重要作用。有文献报道Notch1介导的信号通路是决定骨髓间充质干细胞分化潜能的重要影响因素。本实验比较了绝经后骨质疏松症与健康女性骨髓间充质干细胞Notch1信号通路关键信号分子Notch1、Jagged1和Hes1的表达情况,发现上述关键信号分子在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的表达明显低于正常组,差异有统计学意义(P<0.01)。已有文献报道,骨质疏松患者骨髓间充质干细胞增殖能力和分化能力均有所降低,本实验结果与其一致。由此推测,Notch信号通路的减弱与绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞减弱增殖能力及分化能力有关,可能是导致绝经后骨质疏松症患者骨量降低的原因之一。本实验证实,雌激素可以逆转绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞已减弱的Notch信号通路关键分子的表达,使用雌激素干预绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞后,受体Notch1与配体Jagged1表达均升高,Hes1也显著升高。提示雌激素与Notch信号通路间可能存在一定联系。在人骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化过程中给予雌激素刺激,发现在成骨分化的早期以及成脂分化的过程中,Notch信号通路关键分子表达较未给予雌激素刺激组均增高。图7表明,在