基于rho信号通路的nogo-66的研究进展

基于rho信号通路的nogo-66的研究进展

成年饲料中枢神经系统的再生能力非常薄弱，主要与两个因素有关。（1）成年cns金元的再生能力降低；（2）cns金元的内部和外部环境受到各种外源性抑制因素的影响。目前,人们已经在CNS中分离出了多种抑制神经再生的因子,其中髓鞘相关蛋白因子是最重要的也是研究最多的因子。现已明确CNS髓磷脂中至少有4种神经生长抑制因子:Nogo(Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C)、髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein,MAG)、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte-myelinglycoprotein,OMgp),以及软骨素硫酸盐糖蛋白(chondroitionsulfateproteoglycans,CSPGs),其中Nogo因其具有很强的轴突生长抑制作用而倍受关注,本文就Nogo作用机制的最新研究进行综述。1神经突生长抑制因子1988年,Schwab等从大鼠CNS髓鞘中分离出了分子量分别为35kD和250kD两种蛋白质,并证实这两种蛋白对神经突生长具有强烈抑制作用,命名为神经突生长抑制因子(neuritegrowthinhibitor,NI)即NI35,NI250。1998年Spillmann等又从牛脊髓中提取出了相当于大鼠NI250的牛的同源物bNI220,两者即Nogo-A。1.1ogo-a分析2000年,Nogo基因被成功克隆。通过对牛的bNI-220蛋白(NI-250的同源物,即Nogo-A)6个肽段的分析,Chen、Gramdpre和Prinjha所在的3个实验室几乎同时分别克隆出抑制受损轴突再生的基因——Nogo基因。人类Nogo基因定位于第二位染色体上(2p14-p13),长度在75kb左右,包含14个外显子,8个内含子,最终编码形成三种异构体。1.2nogo-66细胞外区域经DNA序列分析和Northern杂交表明,由于启动子与剪切方式的不同,Nogo基因有3种mRNA转录体,分别编码3种Nogo蛋白:Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C。人的Nogo-A(hNogo-A)由1192个氨基酸残基组成,是Nogo基因全长表达物,相当于大鼠的NI-250;Nogo-B缺少Nogo-A细胞外区域第186~1004位氨基酸片段,由360个氨基酸残基组成,相当于大鼠的NI-35;最短的是Nogo-C,由199个氨基酸残基组成。这3种蛋白质的氨基端没有同源性,没有典型的分泌信号肽序列。它们的共同点是:都有一个由188个氨基酸组成的羧基末端,靠近羧基末端,有2个长度分别为35和36个氨基酸的疏水结构域,即跨膜区;二者被一包含66个氨基酸残基的亲水结构域分开,这一细胞外序列称为Nogo-66。这一区域与主要定位于内质网的浆膜蛋白家族有很高的同源性,而Nogo-A也主要存在于CNS少突胶质细胞内质网,故认为Nogo蛋白是网状蛋白质家族(reticulonprotein,Rtn)的第4个成员——Rtn4。Nogo-A全长至少存在两个独立的抑制神经元活性的功能域:一个是位于细胞表面的Nogo-66环状区域;另一个是氨基端序列区段(amino-Nogo),被称作Nogo-A中心控制区域,amino-Nogo一部分在细胞表面,另一部分则位于细胞质。有实验显示这两个结构域在抑制轴突生长方面发挥着协同作用。1.3nogo-a在临床上的表达Oertle等研究发现,Nogo-A主要在脑内表达,Nogo-B几乎无处不在,而Nogo-C主要在肌肉组织中表达。Nogo-A除主要在CNS少突胶质细胞表达外,在某些神经元内也有表达,特别是发育中的神经元,但在星形胶质细胞和雪旺氏细胞中未见分布。目前对大鼠体内Nogo-A的分布已有了比较全面的研究,在成年大鼠的大脑皮质、基底神经节、丘脑、下丘脑、延髓、脑桥、小脑、中脑、脊髓前后角及视神经中均有Nogo-A的表达,在外周组织肌肉、睾丸和心脏中也检测到Nogo-A。其细胞内的定位可以在细胞质、细胞核、甚至某些细胞器中也可见。2nogo-66和ngr在脑内信号传导中的作用Nogo-A在体内功能的发挥是通过其受体来实现的。Strittmatter等通过筛选小鼠cDNA文库,发现了Nogo-A的唯一受体即NgR。NgR是由473个氨基酸残基组成的富含亮氨酸重复序列的糖蛋白,可与Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C共有的Nogo-66区域相结合。NgR的氨基端包含一信号肽,其后是8个富含亮氨酸的重复区域(LRR),羧基端富含半胱氨酸,与糖基化磷脂酰肌醇(GPI)相连,并通过GPI连接于细胞表面。最近人们在脑中发现了NgR的两种同源蛋白:NgR-H1和NgR-H2,它们在结构和生化特性上与NgR相似,在C-末端富含亮氨酸重复片段(LRRCT),并且含有GPI信号序列,N-末端也富含亮氨酸重复片段(LRRNT)。因此NgR-H1、NgR-H2和NgR可能组成了一个新的受体蛋白家族,在Nogo信号传导中共同起作用。NgR在CNS的表达相当广泛,在大脑皮层、海马结构、杏仁体和背侧丘脑内高度表达,在红核和前庭神经核内中度表达,白质内表达较弱;小脑内小脑深核表达强度高于颗粒细胞,而颗粒细胞又高于Purkinje细胞;在脊髓和感觉神经元内表达很弱;在外周组织心和肾中也有低水平的表达。3nogo及其受体在中枢神经再生中的作用3.1nogo-a的抑制性Nogo蛋白是少突胶质细胞分泌的一种CNS轴突生长抑制因子,它的主要功能是抑制损伤后轴突的再生,这点也通过实验得到了充分的证实。一方面,在体内或体外表达Nogo蛋白都能强烈抑制损伤后轴突的再生。实验发现,cDNA全长重组的Nogo-A能以剂量依赖的方式抑制3T3成纤维细胞轴突的伸展和DRG神经元神经纤维的生长,同时,中枢神经系统损伤后,Nogo蛋白的表达量也随之增加。此外,单独表达Nogo-A的两个抑制性功能域Nogo-66和amino-Nogo,轴突的再生也会受到抑制。另一方面,抑制Nogo的功能或阻断其下游信号通路,轴突再生能力可以得到恢复。研究发现,与野生型相比,Nogo-A基因敲除小鼠脊髓损伤后,轴突的再生能力大大增加,皮质脊髓内的轴突可广泛延伸至横断面,神经纤维大量再生并进入侧索节段;在用Nogo-A的单克隆抗体IN-1处理后,大鼠的受损脊髓的运动功能得到了恢复,部分皮质脊髓束轴突能再生1cm左右,而对照组却不能。据报道,NgR的竞争性拮抗剂NEP1-40可以阻断Nogo-66与NgR的结合,从而促进受损CNS轴突的生长及功能的恢复。此外,成年小鼠脊髓损伤后,若使用C3或Y27632阻断Rho或ROK,其轴突的再生能力增强,同时其后肢运动功能也可以恢复。目前所知,Nogo-A可能通过3种方式抑制神经元轴突再生:(1)细胞方式,即完整少突胶质细胞表面的Nogo-66与损伤神经元的NgR结合;(2)细胞膜方式,即从受损少突胶质细胞脱落下来的含Nogo-66的膜片段与损伤神经元的NgR结合;(3)完全溶解的少突胶质细胞释放Nogo-A抑制性功能区amino-Nogo和Nogo-66的可溶性蛋白水解片段,amino-Nogo和Nogo-66共同产生更强的抑制作用。在损伤脊髓神经组织中,多数情况下3种方式同时存在,介导Nogo-A抑制中枢神经元轴突再生的作用。3.2nogo蛋白在神经系统中的作用从发现Nogo起,人们对其功能的定位一直都是抑制轴突的再生。然而,近来的研究却发现,Nogo不仅在成年动物CNS内有表达,在整个发育过程中从胚胎阶段到出生后的不同发育阶段,Nogo-A都维持较高水平的表达,这就提示Nogo在CNS中的作用不仅仅限于抑制轴突的再生。Mingorance等发现Nogo蛋白在胚胎早期的表达与神经环路连接有关,而不抑制海马神经元轴突的生长。大量研究表明,Nogo-A在神经系统的发育中起重要的作用。在胚胎发育早期,Nogo-A可以参与髓鞘的形成,促进神经细胞迁移和轴突生长,保证轴突朝靶组织定向生长,尤其是保证轴突沿轴索方向长距离生长。综上所述,Nogo蛋白在神经系统中的作用是非常复杂的。在发育的早期,Nogo在CNS中主要起促进作用;但在发育的后期及成年时期,Nogo主要作为抑制蛋白起作用,阻止神经轴突过度生长,确保轴突停止在合适的边界,避免神经纤维过度增生;神经系统损伤时,Nogo能够使生长锥坍塌而抑制损伤神经元的轴突再生。因此,要全面、清楚地认识Nogo在CNS中地位和作用,尚需更深入的研究。4nogo影响中枢系统轴的突然再生分子机制4.1nogo受体的结构Nogo对靶细胞的作用是通过其受体NgR的介导而实现的。实际上,NgR不仅能够介导Nogo蛋白的功能,它还是CNS髓鞘中另外两种轴突生长抑制蛋白——髓磷脂相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)的共同受体,即NgR是这3种轴突生长抑制蛋白发挥作用的集中点。实验表明,在Nogo-A的两个功能结构域中,只有Nogo-66可以和NgR相结合,amino-Nogo则不能;OMgp和Nogo-66在NgR上的结合位点可能有重叠,而MAG和Nogo-66在NgR上则有独立的结合位点。由于NgR是糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白,它附于细胞的表面而不跨越细胞膜,因此其信号的转导必须依赖于其他的跨膜蛋白,即需要有额外的跨膜蛋白来转导。早在2002年,研究者已经证实,这种能将抑制信号传导至神经元内部的跨膜蛋白就是p75神经营养素受体(p75neurotrophinreceptor,p75NTR)。p75NTR是一种低亲和力的神经营养因子(NTR)受体,它与NgR的结合位点位于NgRC-末端的LRR区。Park等报道,p75NTR并非是与NgR结合的唯一跨膜蛋白,一种肿瘤坏死因子(tumornecrosisfacor,TNF)家族成员——TROY/TAJ有着与p75NTR相同的作用。在某些情况下p75NTR的功能可被TROY/TAJ替代,然而两者是否存在功能分工上的差异,还有待进一步研究。此外,2004年,Lee等报道了NgR的另一种协同受体——LINGO-1,它在信号的跨膜传递过程中也有重要的作用。由此,就目前所知,Nogo受体实际上是由NgR、p75NTR/TROY、LINGO-1等三种蛋白组成的受体复合物,三者密切配合,共同完成Nogo信号的跨膜传递。NgR-p75NTR-LINGO-1受体复合物与Nogo-A结合后,抑制信号从胞外跨膜传递至胞内,通过p75NTR与胞内信号分子Rho的结合,启动Rho/ROCK信号通路,最终完成胞内信号的传导。Rho属于小鸟嘌呤核苷三磷酸酶(smallGTPase)家族,正常状况下,Rho与鸟嘌呤分离抑制因子(GDI)结合处于非激活状态,当胞外信号传来时,Rho-GDI结合GDP形成Rho-GDP,后者在鸟苷酸交换因子的作用下形成Rho-GTP而激活。参与Nogo信号传导的Rho家族成员主要有RhoA、Racl、Cdc42,三者作用间的平衡与生长锥的进一步迁移有关。Rho活化后,通过Rho激酶使RhoA水平上调,导致生长锥胞体的回缩,同时Racl、Cdc42水平降低使生长锥上丝足和伪足收回,最终崩溃,轴突再生受到抑制。4.2ca2+对轴突生长的影响Ca2+在Nogo-A信号传导中的作用已被很多实验所证实。研究发现,细胞内Ca2+浓度升高能促进生长锥的延伸,使轴突再生能力增强。有学者认为Ca2+参与的可能是amino-Nogo抑制轴突生长的信号通路。但也有Ca2+浓度过高反而促使生长锥溃变的报道。4.3轴突再生的基因表达轴突生长相关基因是一类与轴突的生长和再生密切相关的基因,轴突的再生需要