《细胞生物学》-细胞13章 细胞死亡与细胞衰老1

Chapter13

CellDeathandCellaging

蝌蚪发育过程中尾巴的退化涉及细胞的编程性死亡和细胞坏死过程正确错误AB提交单选题10分细胞凋亡是（）细胞受到某些外界因素侵袭细胞内含物外泄的过程细胞主动发生自然死亡过程ABC提交单选题10分第一节、细胞死亡细胞死亡：生命现象不可逆的停止。Threewaysofanimalcelldeath:Apoptosis:细胞凋亡（希腊意思是droppingoff像花瓣或树叶落下）；Necrosis:细胞坏死（希腊意思是makedeath使之死亡）；Autophagy:细胞自噬细胞死亡的鉴定：中性红和台盼蓝染色（一）、细胞凋亡的概念及特征程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)又称细胞凋亡（apoptosis）。细胞在一定的生理或病理条件下，是一个由基因决定的主动结束生命的过程。1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞这些的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。一、细胞凋亡1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。

1986年，Horvitz研究线虫突变体，使细胞凋亡概念在基因水平上阐述。2002年获诺贝尔生理学医学奖。凋亡的形态特征a正常T细胞杂交瘤细胞b凋亡细胞(扫描电镜)c凋亡细胞(透射电镜)左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞

程序性死亡细胞的形态结构变化（1）凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。（2）凋亡小体的形成（3）吞噬：凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化细胞凋亡的生化特征（参考）（1）细胞凋亡的主要特征是形成大小为180～200bp特征性的DNAladders——发生核小体间断裂。（2）凋亡细胞tTG（组织转谷氨酰胺酶tissueTransglutaminase）积累并达到较高水平。tTG催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持凋亡小体的完整性，防止有害物质滲漏。－tTG活性依赖于Ca2＋，生活细胞内Ca2＋浓度低，故其活性低；凋亡起始时，Ca2＋浓度上升，从而活性升高。－tTG催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持凋亡小体的完整性，防止有害物质滲漏。（二）、细胞凋亡的检测1.形态学观测：⑴染色法:（staining）台盼蓝（trypanblue）:活细胞排斥，但可使死细胞着色；DAP1：是常用的一种与DNA结合的荧光染料，用DAP1染色借助荧光显微镜，可以观察到细胞核的形态变化；姬姆萨（Giemsa）：可以使染色质着色，便于在普通光学显微镜下观察到染色质固缩、凋亡小体的形成等凋亡过程。（2）透射和扫描电镜观察：可观察凋亡细胞的形态、结构变化，如染色质固缩、凋亡小体的形成、细胞发泡等现象。DAP1染色显示凋亡细胞的染色质凝集A：正常细胞核B：凋亡细胞核细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker

2.DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带即凋亡细胞的DNA由于在核小体间发生断裂，产生200bp及其整倍数的片段，经琼脂糖凝胶电泳呈现出的梯状条带3.TUNEL测定法：即DNA断裂的原位末端标记法针对DNA分子中断裂缺口中的3’OH进行原位标记，凋亡细胞的核DNA中产生的3’OH末端，可帮助荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察。

左：正常16体节期的斑马鱼胚胎在发育过程中有少量细胞发生凋亡；右：突变体的中枢神经细胞发生大量凋亡4.彗星电泳法（cometassay）彗星电泳法的原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再进行短时间的电泳，并用荧光染料染色。凋亡细胞中的DNA降解片段在电泳时迁移较快，使细胞核呈现出一种彗星式图案，而正常细胞核则保持圆球形。5.

流式细胞分析：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。6.检测细胞膜成份变化：细胞凋亡早期，位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻（AnnexinV标记）至细胞膜外侧细胞凋亡的重要特点是（）DNA随机断裂DNA发生核小体间的断裂70S核糖体中的rRNA断裂80S核糖体中的rRNA断裂ABCD提交单选题10分（三）、细胞凋亡的生理意义（1）保证个体发育，塑造器官形态；

例如：健康成人的骨髓和肠组织中，每小时约有10亿个细胞凋亡，但并不引起炎症；发育过程中手和足的成形过程；蝌蚪尾的消失；脊椎动物的神经系统的发育。程序性细胞死亡在小鼠脚趾形成中的作用蝌蚪向蛙发育的变态反应中程序性细胞死亡的作用程序性细胞死亡对发育中神经细胞数量的调节动物细胞数量控制的途径（2）细胞凋亡参与免疫耐受的形成；免疫细胞为什么不攻击我们自身呢？淋巴细胞的克隆选择过程中，凡是不能区分“自我”与“异我”抗原的淋巴细胞均发生凋亡。举例：自身免疫性淋巴增生综合症（Fas配体和Fas受体均发生突变）→使得增生的T淋巴细胞无法正常凋亡。举例：AIDS患者表现为过多的淋巴、非淋巴细胞凋亡，免疫力低下（3）维持生物的自稳态；动物成体通过调节细胞凋亡和增殖的速率来维持组织器官细胞数量的稳定以及成体细胞的自然更新。如果用药物苯巴比妥处理，......？

（4）去除受损的或者病变的细胞当DNA受损的时候或者细胞发生癌变的时候，包括细胞发生其他病变，这个时候肿瘤抑制基因P53表达，介导细胞发生凋亡，从而从机体清除。

因此，凋亡是机体预防癌症发生的重要手段。凋亡不足，容易导致细胞癌变和自身免疫疾病凋亡过度，容易导致神经退行性等疾病凋亡过程必须受到严格的调控（四）诱导细胞凋亡的因子物理性因子：包括射线（紫外线，γ射线等）、较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。化学及生物因子：包括活性氧基团和分子、Ca2+载体、激素、细胞生长因子、DNA和蛋白质合成的抑制剂、细胞毒素和肿瘤坏死因子α（TNFα）等。（五）、程序性细胞死亡的机理2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔（SydneyBrenner）、美国人罗伯·霍维茨(RobertHorvitz)和英国人约翰·苏尔斯顿(JohnESulston)，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）方面的研究获诺贝尔生理与医学奖。发现了程序性细胞死亡的关键基因。秀丽隐杆线虫（秀丽新小杆线虫）参与细胞程序性细胞死亡的基因

细胞凋亡的基因调控机制最先是从线虫（Ｃ.

elegas）研究开始的。线虫是一种细胞定数细胞，在个体发育中，成体的1090个体细胞中，有131个注定是要自然凋亡。在线虫中已发现14个与细胞凋亡相关的基因。其中研究得比较深入的有促进细胞凋亡的ced-3和ced-4基因，以及抑制细胞凋亡的ced-9基因。雌雄同体的秀丽新小杆线虫秀丽新小杆线虫(秀丽隐杆线虫)(CaenorbabditisElegans)：1090个细胞，其中131个细胞凋亡秀丽新小杆线虫中参与程序性细胞死亡控制的基因●决定死亡的2个基因(影响特异细胞类型PCD的基因)，即ces-1(ces表示CE细胞存活的调控基因)和ces-2基因，以及cgl-1和her-1。●执行死亡的4个基因：ced-3、ced-4、ced-9。●7个与死亡细胞被吞噬细胞所吞噬的基因，即ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-8和ced-10●死亡细胞在吞噬体中被降解的基因，核酸酶基因1，即nuc-1。保守性高，在哺乳动物中有相应同源物：Ced-3=ICE(caspase-1),Ced-4=Apaf-1,Ced-9=Bcl-2进一步分析表明：●ced-3、ced-4、ced-9和egl1-4个基因构成了线虫执行死亡的“死亡机器”(deathmachinery);●ced-3和ced-4是细胞杀手;●ced-9可抵消ced-3和ced-4

的作用，防止细胞被杀死，因此是存活因子;●进一步的研究发现真正的细胞杀手是ced-3而不是ced-4，ced-4是转换器。程序性细胞死亡相关基因程序性细胞死亡遗传学相关基因：ced-1～ced-9,nuc-1,ces-1,ces-2,egl-1;促进程序性细胞死亡基因：ces-2,ced-3,ced-4,P53,c-myc,Ela,ICE,TNF-α,APO-1/fas抑制程序性细胞死亡基因:egl-1.ces-1,ced-9,bcl-2,Elb,EBV-LMP-1,BHRF-1,crmA,A-20动物细胞中蛋白质酶解级联系统对程序性细胞死亡的介导通过自杀性蛋白水解酶家族介导；该蛋白酶通过自我切割而激活；自杀性蛋白酶可激活蛋白家族中的其它成员，引起蛋白酶降解的级联反应。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）◆自杀性蛋白水解酶是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteineasparticacidspecificprotease),简称caspase。ICE基因：哺乳动物中克隆出的与线虫细胞凋亡基因ced-3的同源基因，即白介素-1β转换酶。后被命名为Caspase-1。。ICE是一个半胱氨酸蛋白酶。ICE基因定位于人类染色体11q23，其cDNA全长1.35kb，编码由404个氨基酸残基组成的45kd蛋白。迄今已发现了11个同源基因，1996年后这些家族成员统称为Caspase，它能选择性地切割蛋白质使其失活或激活。caspase家族成员基本功能Caspase1Caspase11不直接参与细胞凋亡信号的传导(参与炎症)Caspase4Caspase2Caspase8参与细胞凋亡的起始(起始者)Caspase9Caspase10Caspase3Caspase6参与细胞凋亡的执行（效应者）Caspase7二、细胞坏死细胞坏死与程序性细胞死亡两者比较原因不同：坏死由物理、化学损害因子及缺氧与营养不良引起，凋亡由基因控制。过程不同：坏死细胞肿胀，质膜渗透性增高，细胞器变形，肿大，早期核无明显形态学变化，而程序性细胞死亡不出现细胞膨胀，而是收缩并被割裂成膜性小泡后被吞噬。结果不同：坏死细胞释放内含物，引起炎症反应，程序性细胞死亡没有完全破裂，不会引起炎症反应。坏死与程序性细胞死亡凋亡和坏死的对比ApoptosisNecrosisDeathbyapoptosisisaneat,orderlyprocess凋亡、坏死比较细胞凋亡细胞坏死能量ATP不依赖ATP细胞形态皱缩肿胀细胞膜完整破裂细胞器形态完整肿胀破裂细胞核染色质凝集断裂固缩，核膜破裂凋亡小体有无DNA规律断裂，梯状条带随机降解分子机制多基因参与，有序调控无基因调控蛋白质合成有无代谢反应蛋白酶逐次参与无秩序反应周围组织炎性反应无有对机体的影响生长发育代谢需要有损伤破坏作用三、细胞自噬形成自噬（小）体，然后与溶酶体融后被消化。可能为凋亡的替补途径发生条件：营养危机，胚胎发育及变态过程（昆虫）。自噬相关基因：Atg（autophagy-relatd）基因,丝氨酸、苏氨酸激酶。机制：激活磷酰肌醇激酶PI3K，再激活AKT/PKB，活化蛋白激酶mTor,抑制Atg激酶活性。细胞自噬的特征及其过程下列哪项不属于细胞程序性死亡方式()动物细胞的凋亡A自噬性细胞死亡B高温使得生物大分子瞬间发生化学改变而导致的细胞死亡C程序性坏死D提交单选题10分下列不能作为判断细胞是否发生凋亡的依据是()琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯状条带(DNALadders)ADAPI染色观察凋亡细胞核形态变化和染色质凝集B电镜下观察细胞表面形成的凋亡小体C电镜观察细胞质出现空泡,质膜破损,细胞内含物释放到胞外D提交单选题10分由基因控制的程序性死亡仅存在于动物,植物等多细胞生物,单细胞生物不存在程序性死亡()正确A错误B提交单选题10分本章概要（一）细胞死亡往往受到细胞内某种由遗传机制决定的“死亡程序”控制，所以被称为细胞程序性死亡。动物细胞典型的程序性死亡方式包括凋亡与坏死。细胞凋亡对于生物体的正常发育、自稳平衡及多种病理过程具有极其重要的意义。其最重要特征是凋亡过程中细胞膜保持完整，细胞内含物没有泄漏到细胞外，不引发机体的炎症反应。这也是细胞凋亡与坏死的主要区别。细胞凋亡的另一个重要特征是染色质DNA在核小体间发生断裂，形成间隔200

bp的DNA片段。在动物细胞的凋亡过程中