椰露止咳合剂中鱼腥草和甘草的薄层鉴别方法的改进

椰露止咳合剂中鱼腥草和甘草的薄层鉴别方法的改进

椰子露止咳汤由鱼粪、椰子浆、贝母和甘草等七味中药组成。具有净化粘液、止咳、咽喉的功效。用于治疗肺热久咳挟风所致的咳嗽痰稠、咽痒、喉痛、口干等症,试行标准号为WS-5082(B-0082)-2002。目前标准中鱼腥草仅对水解成分槲皮素进行薄层鉴别,专属性不强,且供试液制备方法繁琐,甘草薄层色谱效果不够理想。本文对鱼腥草的供试液制备方法及薄层色谱展开条件进行了优化,并增加了鱼腥草对照药材的鉴别;对甘草鉴别项下供试品溶液的制备方法进行了考察,优化了薄层色谱展开条件,增加了甘草酸铵对照品的鉴别。1药品对照试剂暗箱式紫外检测仪(WD9403C,北京市六一仪器厂);硅胶G(青岛海洋化工厂);其余试剂均为分析纯;槲皮素对照品、鱼腥草对照药材、甘草酸铵对照品、甘草对照药材均购自中国药品生物制品检定所;椰露止咳合剂样品及阴性样品(国药控股深圳中药有限公司)。2方法和结果2.1鱼和草的区别2.1.1供试品溶液的制备取本品20mL,置分液漏斗中,加水20mL,滴加5滴稀硫酸,摇匀,用水饱和乙酸乙酯萃取2次,每次20mL,合并乙酸乙酯液,用乙酸乙酯饱和水洗涤2次,每次20mL,蒸干,残渣用50%乙醇20mL使完全溶解,转移至圆底烧瓶中,加入稀硫酸8mL,水浴回流1h,取出,放冷,以乙酸乙酯萃取2次,每次20mL,合并乙酸乙酯液,乙酸乙酯饱和水洗涤2次,蒸干,残渣加甲醇2mL使溶解,作为供试品溶液。2.1.2对照药材溶液的制备取鱼腥草对照药材1g,加水50mL,煎煮1.5h,水煎液滤过,滴加5滴稀硫酸,摇匀,以水饱和乙酸乙酯萃取2次,每次20mL,合并乙酸乙酯萃取液,乙酸乙酯饱和水洗涤2次,蒸干,以50%乙醇20mL转移至圆底烧瓶中,加入稀硫酸8mL,加热回流1h,取出,放冷,以乙酸乙酯萃取2次,每次20mL,合并乙酸乙酯液,乙酸乙酯饱和水洗涤2次,蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为对照药材溶液。2.1.3对照溶液的制备取槲皮素对照品,加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液,即得。2.1.4准分离溶液的制备取自制缺鱼腥草的阴性样品,照“2.1.1”项下方法制备阴性对照溶液。2.1.5苯甲酰胺的色谱分析按照薄层色谱法(2005年版中国药典一部附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各8μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,在80℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与槲皮素对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,见图1;置紫外光灯(365nm)下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,见图2。2.2甘草的识别2.2.1正丁醇液的制备取本品20mL,正丁醇提取2次,每次20mL,合并正丁醇层,水洗涤3次,蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至5mL量瓶中并定容至刻度,摇匀,即得。2.2.2药渣中正丁醇提取取甘草对照药材1g,加乙醚40mL,加热回流1h,滤过,滤液弃去,药渣加甲醇30mL,加热回流1h,滤过,滤液蒸干,残渣加水40mL使溶解,用正丁醇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,水洗涤3次,蒸干,残渣加甲醇定容至5mL,即得。2.2.3对照溶液的制备取甘草酸铵对照品,加甲醇制成每1mL含2mg的溶液,即得。2.2.4阴性样品溶液的制备取自制缺甘草的阴性样品,照“2.2.1”项下方法制备阴性样品溶液。2.2.5乙酸乙酯-苯甲酸-冰醋酸-水5.2.3照薄层色谱法试验,取上述甘草对照药材溶液、甘草酸铵对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5μL,分别点于同一块自制1%NaOH硅胶G板(活化1h)与预制硅胶G板(活化1h后,置展开缸中,氨熏1.5h)上,以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷10%硫酸乙醇,晾干,于105℃加热,置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中,在与对照品及对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,见图3。3讨论3.1提取溶剂的选择因标准中鱼腥草对照药材溶液制备方法较为繁琐,故本实验对其提取方法进行了考察:A.药材加入稀硫酸水浴回流水解后,加乙酸乙酯提取2次;B.药材加1%氢氧化钠溶液煎煮,过滤,滤液加乙酸乙酯提取2次,蒸干,残渣加入稀硫酸水解,再加乙酸乙酯提取2次;C.药材加1%氢氧化钠溶液煎煮,过滤,调pH至1～2,乙酸乙酯提取2次,蒸干,残渣加稀硫酸水解,再加乙酸乙酯提取2次;D.参照原标准中制剂方法将药材用水煎煮后再按供试品溶液制备方法制备。以上4种方法制备的对照药材溶液、对照品溶液分别点样,对比斑点情况,结果表明只有D方法制备的供试液出现槲皮素的斑点,故决定采用D方法制备对照药材供试品溶液。A.本实验在方法摸索的过程中曾参考文献分别采用硅胶G板及聚酰胺薄膜进行展开,结果比较,采用硅胶G板法不但操作更为方便,并且分离效果较好,供试品溶液与对照药材薄层色谱中呈现的对应斑点较多,故确定硅胶G板法作为薄层鉴别方法;B.对展开剂进行了考察,分别对石油醚-乙酸乙酯-甲酸、氯仿-甲酸、甲苯-乙酸乙酯-正己烷、甲苯-乙酸乙酯-甲酸等展开系统进行比较,结果表明甲苯-乙酸乙酯-甲酸系统展开效果最为理想,并最终确定展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)。鱼腥草在展开过程中,若展距过低,则会明显影响展开效果,故实验操作中展距应不小于15cm。3.2a种方法所产生的供试品3.2.1供试品溶液制备方法的选择:A.参考2005年版中国药典一部中甘草的处理方法,采用正丁醇提取2次,合并正丁醇层,水洗涤3次,蒸干,残渣加甲醇溶解定容;B.原标准方法采用稀HCl调pH值至1～2后再用三氯甲烷提取2次,合并三氯甲烷层,蒸干,残渣加甲醇溶解定容;C.先用乙酸乙酯提取2次,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣加甲醇溶解定容。结果比较:A、C两种方法所得供试品斑点好于B种方法,C种方法乳化现象严重,且几乎不能消散,A种方法乳化现象相对较好,且易消散,故采取A种制备方法。3.2.2薄层条件的选择:本实验在方法摸索的过程中曾参考文献方法分别采用硅胶G板(活化1h后,置展开缸中,氨熏1.5h)及1%NaOH硅胶G板进行展开,结果比较,两种板展开效果均较理想,但考虑到氨熏的方法难