神经轴突再生抑制因子nogo基因的研究进展

神经轴突再生抑制因子nogo基因的研究进展

成年后，中枢神经系统的再生能力显著降低，外耳神经仍有一定的再生能力，这表明人们认识到中枢神经系统的再生能力。除了形成骨肿瘤是转化的物理障碍外，由于中枢神经系统缺乏神经生长因子，因此存在神经生长抑制因素。科学家们还找到了证据来证明这一假设。目前人们发现的神经轴突再生抑制因子包括可溶性髓磷脂相关糖蛋白(myelinassociatedglycoprotein,MAG)、少突细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocytemyelinglycoprotein,OMgp)和Nogo蛋白。Nogo有3种同源异构体:Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C,它们均通过Nogo受体(neuronalglycosylphosphatidylinositol-anchoredreceptors,NgR)发挥轴突生长抑制作用。1氨基酸的检测2000年,瑞士、美国和英国的3个科研小组同时发现一种能抑制中枢神经损伤后再生的基因,将其命名为Nogo基因,它所编码的蛋白质命名为Nogo蛋白,是网状蛋白家族的成员。Nogo基因序列上的不同启动子和不同拼接使之可形成3个mRNA的转录体,它们所编码的蛋白质分别称为Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C,长度分别为1163、360、199个氨基酸。Nogo-A中间的173-975个氨基酸为特异性氨基酸序列,Nogo-B没有特异性氨基酸序列,Nogo-C氨基端的1-11个氨基酸为特异性氨基酸序列。Nogo-A和Nogo-B在氨基端有相同的172个氨基酸序列;这3种蛋白质在近羧基端都有相同的188个氨基酸序列,且都有2个长度分别为35和36个氨基酸的疏水跨膜区。Nogo分子的氨基端和羧基端都位于细胞浆,3种Nogo分子的羧基端2个跨膜区之间均存在一个66个氨基酸的结构域Nogo-66,它位于内质网腔或细胞膜外,是Nogo分子的功能区,可抑制中枢神经细胞轴突生长并能诱导细胞生长锥塌陷。目前已知Nogo-A是突触再生抑制物,Nogo-B是血管重塑调节物,Nogo-C在骨骼肌高表达,在肝脏、肾脏低表达,通过JNK-c-Jun-依赖的通路由细胞凋亡蛋白3和p53诱导,与细胞凋亡相关。2arg118不同的机制MAG是最早被鉴定的中枢神经系统轴突生长髓鞘抑制因子,是免疫球蛋白超家族唾液酸结合亚组成员,其相对分子质量约为100kD,约含600个氨基酸,包括1个较长的胞外区,1个跨膜区和2个胞内区,胞外结构域含有5个Ig样结构域,氨基序列中的Arg118影响MAG与轴突结合,当Arg突变为Ala、Asp时与轴突结合的作用消失。MAG不但存在于中枢神经系统,外周神经系统中也有MAG的存在,MAG在新生动物有促进神经纤维生长的作用,但在成年动物则为抑制作用。它既是维持有髓轴突受体的配体,又是促进少突胶质细胞分化、维持和存活的轴突信号的受体,主要表达在少突胶质细胞和雪旺氏细胞,在中枢神经系统有2个功能:维持髓鞘的完整性和抑制中枢神经系统轴突再生。MAG与其他糖蛋白结合,是周围神经髓鞘上自主免疫的靶抗原,已证明在多发性硬化患者中与突触的病理损伤有关。尽管均通过NgR起作用,但MAG与Nogo-66作用明显不同,MAG可能是结合在与Nogo-66不同的NgR的结合部位。MAG有几个神经结合配体,其中几个可与NgR复合物或其下游信号相互作用。3糖基磷脂酰肌醇OMgp是一种中枢神经系统白质内多肽合成的特异性糖蛋白,大约只占髓磷脂蛋白的0.05%,位于髓鞘及少突胶质细胞的外表面。它是少突胶质细胞和髓鞘表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白,含有433个氨基酸残基,有4个结构域,N末端有一个富含半胱氨酸的短基序,富含亮氨酸的区段(LRR)可能在与NgR结合中起作用,与O-糖基位点结合的富含丝/苏氨酸的区段以及疏水的C-末端,其LRR区高度保守,可能与其功能作用有关。在发育期,它的出现比其他髓磷脂蛋白出现晚,其生理功能可能是在髓鞘形成的过程中与终止信号的发出有关。OMgp可能是引起某些自身免疫性疾病(如多发性硬化)的靶抗原。4跨膜分子与nrNgR含473个氨基酸残基,氨基端有1个信号肽,其后为8个富含亮氨酸的重复区,羧基端含丰富的半胱氨酸,与GPI相连。但作为一个糖基醇磷脂结合蛋白,它缺乏细胞内片段,所以其信号向胞内传导必定要借助其它跨膜分子。有人认为,NgR借GPI锚定于胞膜脂质层,所以它和配基结合后可能改变与脂质层有关的胞膜内分子的信号。但目前被多数人认同的观点是,存在某种跨膜分子与NgR共同作用,将NgR接受到的来自髓磷脂的抑制信号传递到轴突胞质。实验表明,中枢神经系统髓磷脂中另外2种轴突生长抑制性蛋白——MAG与OMgp,均通过NgR及与其相连的受体复合物发挥作用。Nogo-66与MAG结合于NgR的不同位点,而Nogo-66与OMgp在NgR上的结合位点有重叠,故二者存在竞争。因此NgR似乎是中枢神经系统髓磷脂中各种轴突生长抑制性蛋白发挥作用的集中点。人类的NgR与小鼠的NgR有89%的同源性,其基因的外显子位于22q11染色体上。NgR在中枢神经系统中分布广泛,灰质中含量较高,大脑皮质、海马、脑桥、小脑蒲肯野细胞也有分布,但不存在于少突胶质细胞,外周组织中只有心脏和肾脏有极少量的分布。5神经元营养因子目前普遍认为,NgR通过P75(neurotrophinreceptor,NTR),激活小鸟嘌呤核苷三磷酸酶(smallGTPases)的Rho家族成员——rho、rac1、cdc42,内源性第二信使在其信号转导过程中发挥重要作用。用神经营养因子提高神经元内cAMP水平,激活PKA,使Rho磷酸化而失活,可以阻断髓磷脂对轴突生长的抑制作用。细胞内游离钙也与生长锥延伸和收缩过程密切相关。Nogo-A导致生长锥溃变之前,细胞内Ca2+浓度明显升高。Ca2+与钙调蛋白结合后,激活蛋白激酶,也可以导致Rho磷酸化而失活,促进生长锥延伸。因此可以认为,中枢神经系统神经元损伤后,溶解的少突胶质细胞释放Nogo-A氨基端和Nogo-66的可溶性蛋白水解片段,与其特异性受体复合物结合,通过第二信使作用于Rho,对生长锥中的微丝进行调节,使生长锥溃变,抑制轴突再生。除上述机制外,Nogo-A还对轴突生长相关基因有下调作用。5.1髓磷脂协同受体它是一种跨细胞膜的神经营养素受体,其胞质部分与Rho作用,而Rho已被证明能介导髓磷脂对轴突生长的抑制作用,所以P75被认为是NgR的协同受体。截除P75的跨膜和胞内结构域,与碱性磷酸酶融合形成融合蛋白P75-AP,发现其仍然可以和全长的NgR结合,说明P75是通过其细胞外结构域和NgR相互作用。5.2基于权值的其他膜组体以往认为NgR的受体复合物由NgR和P75组成,关于其组成近年还有不少新发现。有研究者发现GTI-b(一种神经节苷脂)的抗体可中和MAG的抑制活性,认为它可能是NgR受体复合物中的一员。2004年,Lee等报道另一种NgR的协同受体LINGO-1,也是富亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)包含Ig受体之一。他们发现,NgR-p75复合体只有与LINGO-1共同表达才能传导OMgp的抑制信号,激活胞内的RhoA;在原代神经细胞培养中,如没有LINGO-1,将明显削弱髓鞘成分的抑制作用。因此LINGO-1被认为是NgR-P75受体复合物的一个功能组。GPI-结合于Nogo-66受体(NgR)通过跨膜受体LINGO-1和P75或TROY将信号转导至细胞内。5.3e-g-ro在NgR-P75复合体的下游即神经元胞质内,存在一种GTP结合蛋白RhoA。正常状况下,Rho-GDI(Rho鸟嘌呤裂解抑制子)与Rho-GDP结合,并隐藏在细胞质中处于静止状态。髓磷脂相关抑制因子能促进P75与Rho-GDI的结合,使Rho-GDP释放,在鸟苷酸交换因子(GMPexchangefactor,GEF)的作用下,形成Rho-GTP而激活。Madura等通过体外实验证明,在Nogo蛋白的作用下,Rho明显激活,脊髓损伤的体内实验也发现在损伤区的神经细胞突起有大量的Rho激活。近年有实验将C3酶用于视神经和脊髓的损伤部位,抑制Rho-A,发现视网膜的轴突和皮质脊髓束的纤维明显增生。胞质内还存在Rho相关激酶(Rho-associatedproteinkinases,ROCK)。体外实验发现,ROCK的抑制因子Y-27623能逆转髓磷脂引起的轴突再生抑制,体内实验表明它能促进轴突的再生和运动功能的恢复。这些都提示ROCK是Rho-A的效应器。Nogo及Rho、ROCK通路对细胞迁移、触突导向、树突棘多态性、突触再生和细胞存活有重要作用。5.4troy在体内的功能轴突生长抑制信号主要通过Rho-A途径实现,此外还存在其它信号途径,如Enabled途径和LIMK途径。LIMK是由磷酸激酶(phosphorylatedp21-activatedkinase,PAK)或ROCK催化而磷酸化作为磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)的下游信号,它们共同作用,传递髓鞘的抑制信号,抑制神经轴突的生长再生。此外还存在其它间接的、调节性的信号途径。近年研究发现,外周神经损伤导致初级神经元内cAMP的水平升高,激活蛋白激酶A(PKA),使P75磷酸化,从而改变它在脂质层中的定位;cAMP的水平升高,还可使Rho-A磷酸化而失活,并能上调精氨酸酶Ⅰ的水平,增加聚胺合成。这些都可以阻断髓磷脂对轴突生长的抑制作用。此外,钙离子也被证明是参与Nogo信号的细胞内传导的组成之一。2004年美国科学家MiSha发现在体外非神经元细胞COS27试验中NgR1与P75的结合并不能激活细胞内RhoA信号通路,而只有NgR1、P75与LINGO-1三者的结合才能激活。LINGO-1是LRR家族的成员,它的N端含有12个LRR,有1个Ig区域、1个跨膜区和1个传导信号功能的细胞内尾端。LINGO-1在成年哺乳动物CNS中广泛表达,它在成年动物脑组织中呈高表达,而在正常脊髓中表达很低。但在损伤脊髓轴索中的表达可上升至正常脊髓的5倍。然而,在成年哺乳动物中枢神经系统中只有除背根神经节的部分神经元和其它少数的神经元表达P75外,其它神经元并不表达。难道在中枢神经系统还存在另外一种与P75同一家族且能代替P75的物质吗?2004年2个相互独立的研究小组开始验证这一假设。他们对TNF家族在中枢神经系统中能够广泛表达的分子TROY(TAJ)、CD40、DR6、Fn14、TNFR1和TNFR2通过多种实验技术进行检测,发现只有TROY能够与NgR1和LINGO-1形成复合物LINGO-1/NgR/TROY,而且TROY的作用几乎是P75的8倍。在实验中2个小组发现TROY能够在体外存在Nogo-A、MAG和OMgp的培养基中调节背根神经节和小脑颗粒神经元轴突的生长,通过提高病毒载体介导的TROY的表达加强抑制因子介导的轴突生长抑制作用,然而当除去TROY顶端域的表达时这一作用明显减弱,轴突生长不再受到抑制。这些结果表明,TROY能够传递抑制相关因子信号,并证明TROY从功能上代替LINGO-1/NgR/P75复合物中的P75。TROY的发现能更好地解释为什么敲除P75基因的小鼠在脊髓损伤后,神经再生不明显的现象,为今后研究中枢神经损伤后再生与修复提供了一条新的思路。6ogmp基因缺失抑制轴突生长的信号机制目前的研究已经证实中枢神经系统中的Nogo是髓磷脂中最重要的一种抑制轴突生长锥再生的蛋白质,Nogo-A具有中枢神经抑制活性,Nogo-66仅能特异性地抑制神经纤维的生长,而Nogo的氨基片段则作用更为广泛,除可阻断神经纤维生长,还可抑制非神经细胞的伸展和迁移。MAG能与胶质细胞相互作用,能促进损伤区域少突胶质细胞的存活,还可能参与中枢神经系统髓鞘化的启动。此外,MAG通过所谓的受控的膜内蛋白水解作用(RIP),先后经α和γ-分泌酶2次对P75进行剪切,使之释放出25kD的胞内区(ICD),ICD是蛋白激酶PKC和小GTP酶Rho激活所必需的,由此启动下游信号途径来抑制轴突生长。OMgp不仅对成年轴突生长具有抑制作用,且可以促进新生神经元轴突生长,其富含亮氨酸重复片段结构域参与蛋白间的相互作用,发挥DNA修复、RNA剪接、细胞间黏附及信号转导等功能。研究还发现神经营养因子需要的细胞内信号由结合于细胞表面的Trk和P75受体的配体触发。来自Trk受体的信号支持存活、生长和突触延伸,而来自P75的信号诱导凋亡、