两株链霉菌r1、r2复合微生物肥料对几种真菌的影响

两株链霉菌r1、r2复合微生物肥料对几种真菌的影响

微生物肥料是当前农业生产中常见的肥料。随着不必要的农业生产，微生物肥料变得越来越易用作不可替代的优势。陈育如等应用多种功能菌株混合发酵和添加具有解磷、解钾、分泌植物生长刺激性物质的功能微生物配制了两种复合性微生物肥料(简称菌肥)。为了明确其防病效果,本试验采用室内抑菌试验和苗期人工接种方法,研究了两种菌肥对植物主要土传病原菌的抑制效果。1材料和方法1.1streptomycesp.泾阳链霉菌(Streptomycesjingyangensis)R-1为南京师范大学生命科学学院微生物资源实验室保存菌种,R-2(Streptomycessp.)由本室分离自南京郊区菜田;植物病原真菌草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticilliumalbo-atrum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和R-1、R-2分别与有机肥配制的一号菌肥、二号菌肥均由南京师范大学微生物资源实验室提供。1.2抑菌圈直径测定将菌株R-1、R-2在高氏2号液体培养基上31℃摇瓶培养7d,3500r/min离心15min,取上清液经无菌滤器制成无菌滤液。用纸片法测定对棉花枯萎病菌、草莓灰霉病菌、棉花黄萎病菌的抑菌圈直径。每个病原菌10皿,每皿4片,以沾取无菌水为对照,每处理5次重复。将菌株R-1、R-2摇瓶培养后于121℃、20min高压灭菌制成灭菌过滤液涂布在马铃薯蛋白胨培养基上,用平板涂布法测定对4种病原真菌的抑菌作用。以不涂布灭菌过滤液而接种病原菌为对照,每处理5个重复。1.3过滤液添加量的确定两种烘干菌肥与水(1∶10重量比)按1.2方法分别制成无菌过滤液、灭菌过滤液,两菌株灭菌过滤液按1∶10稀释;将6种过滤液分别与棉花枯萎病菌、草莓灰霉病菌、棉花黄萎病菌孢子悬液混合(每视野30～60个孢子),滴在载玻片上,放入培养皿中,置28℃恒温箱中培养。设无菌水孢子悬液为对照。每隔1h用显微镜观察病原菌孢子的萌发情况,4h后计算病原菌孢子的萌发率。1.4土壤和菌肥的渗透将一号菌肥、二号菌肥及其各自与土壤的混合物(1∶3)分别装入深容器中加入适量无菌水混匀,表面做平放入灭菌滤纸,使其与下层物质紧密接触,在滤纸上倒入灭菌水琼脂,放入4℃冰箱中24h。待土壤和菌肥中的活性物质渗透至水琼脂后,用打孔器打片后移于载玻片上置培养皿中。在湿室环境下滴入棉花枯萎病菌、草莓灰霉病菌、棉花黄萎病菌孢子悬液,每视野30～60个孢子。每处理3次重复,设纯土壤和无渗透琼脂片为对照。每隔1h观察其孢子的萌发情况,4h后计算病原菌孢子的萌发率。1.5苗期的人工接种试验和抗病性试验1.5.1种苗、病毒、种棉花种子(泗棉3号)用清水浸泡24h,发芽后播种于灭菌土壤中。真叶展开期拔出棉苗浸入棉花黄萎病原菌的孢子悬液(3×106/ml)中15min,移植于两种菌肥土壤的小花盆中,每盆5株,以灭菌土壤为对照。每处理5盆。当接种在灭菌土壤中的棉花苗开始萎蔫时调查发病率,共调查3次,间隔5d。1.5.2马铃薯种子的处理马铃薯切成1cm×1cm方块置三角瓶中高温高压灭菌后接种油菜菌核病菌,28℃温箱中培养7d,取出已长满菌丝的马铃薯块,埋入两种菌肥土壤的小花盆中(土下2cm处)培养。以灭菌土壤为对照,每处理3盆。15d后播种油菜种子(四月慢),种子表面经1%次氯酸钠消毒,每盆播种15粒。7d后调查发病率。2结果与分析2.1不同植物病原菌抑菌圈直径比较纸片法测定结果(表1)表明,两菌株无菌过滤液对3种植物病原菌均有不同程度的抑制作用。R-1、R-2二者间差异不显著,但均表现为对草莓灰霉病菌的抑菌圈直径最大。平板涂布法结果(表2)表明,R-1、R-2发酵液的代谢物质明显抑制4种植物病原菌的生长。植物病原菌对照皿中5～7d菌落即可长满,而添加抑菌物质的各皿均生长缓慢,添加R-2的平皿中棉花黄萎病菌菌落几乎没有生长。2.2对病原菌的芽孢杆菌孢子萌发的影响两种肥料的无菌和灭菌过滤液及两菌株灭菌过滤液均对植物病原菌孢子的萌发有影响(图1)。其中二号肥的无菌过滤液对病原菌的孢子萌发抑制效果最好,对草莓灰霉病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌的孢子萌发抑制率分别是69%、50%、42%;二号肥的灭菌过滤液效果次之,但比其它处理效果好。2.3使用抗菌肥,抑制率高从图2可知,在模拟土壤环境中土壤和菌肥溶出到水琼脂的活性物质对草莓灰霉病原菌孢子的萌发明显抑制,抑制率均在86%以上,二号肥与土壤混合物抑制率达到了98%;而棉花黄萎病菌和棉花枯萎病菌仅在添加菌株R-2的二号肥和二号肥与土壤混合的环境下孢子萌发才受到明显抑制,抑制率分别达67%、58%和74%、64%。2.4黄涣病和从油菌核病防治效果试验结果表明,一号肥和二号肥对棉花黄萎病和油菜菌核病均有不同程度的抑制效果,一号肥分别为28%、41.9%,二号肥分别为72%、97.2%。3对微生物肥料的认识本试验中,菌肥灭菌过滤液和无菌过滤液均对病原菌的孢子萌发有影响,但无菌过滤液效果更好。这意味着耐高温的和不耐高温的不同活性代谢物质都在微生物肥料中存在。在模拟土壤环境和苗期人工接种试验中,由于有不确定的土壤物质存在,更接近自然的农业施肥环境,结果与两种微生物肥料在农业生产中应用示范效果接近(待