酵母双杂实验顺序

2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC-AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-TAC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。通过PCR扩增获得带有力汨位点的基因片段，扩增体系和条件见，其中将退火温度改为65°C。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：attB-PCR产物(>10ng/^L) 1-7|iLpDONR221(150ng/|iL) 1pLTEbuffer,pH8.0 补足8|iL将上述混合物加入离心管中，加入2四LBP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25C反应1h，加入1四1蛋白酶K后，混匀离心，37C反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50四g/mLKan抗生素的匚8平板进行阳性克隆筛选，参照检测阳性克隆，然后根据中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。进行BP反应时，需注意以下几项：对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的^如入门载体；为了提高8?反应的效率，可以将建议的25C反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10四L体系中PCR产物最好不要超过250ngo2.1.1.2诱饵载体构建重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下：入门载体(50-150ng) 1-7四LpDEST32(150ng/|iL) 1pLTEbuffer,pH8.0 补足8|iL将上述混合物加入离心管中，加入2^LLRfi应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25C反应1h，加入1四1蛋白酶K后，混匀离心，37C反应10min终止BP反应，将LR反应产物参照进行转化，由于pDEST32载体为Gen抗性，所以选用含有50四g/mLGen抗生素的匚8平板进行阳性克隆筛选，参照检测阳性克隆，然后根据中的方法提取重组质粒，测定质量和浓精心整理度。LR反应注意事项：对于LR反应来说，最高效的是超螺旋的入门载体和目的载体进行反应，但对于超过10kb的载体，将载体线性化可能反而会提高反应的效率；为了提高LR反应效率，可以适当延长反应时间，这对于大于10kb的质粒非常有必要。2.1.1.3转化酵胃细胞转化前需小量制备MaV203酵母感受态细胞，步骤如下：将保存的MaV203菌株在YPAD平板上划线，30°C培养2天；挑取酵胃菌单克隆至10mLYPAD液体培养基中，30C，230rpm过夜培养；将过夜的酵母培养液在50mL的YPAD液体培养基中稀释至OD600为0.4左右，30C，230rpm继续培养2-4h；室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入40mL1xTE(pH7.5)重悬；室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入2mL1xLiAc/0.5xTE重悬；室温静置孵育10min；立即用于下游的酵胃小量转化实验。酵母感受态细胞制备完成后，按照表3-2中的组合进行转化，通过以下步骤将组合载体转入酵母细胞中：向每个1.5mL离心管中加入1瞄质粒、100瞄变性鲑鱼精DNA以及100四L酵胃感受态细胞；加入700四L的1xLiAc/40%PEG-3350/1xTE并上下颠倒混匀，30C孵育30min；加入88四L的DMSO，混匀，然后42C热击7min；在微量离心机中瞬时离心10s，弃去上清；加入1mL1xTE重悬菌体后瞬时离心，弃上清；加入50-100四LlxTE重悬菌体，然后涂在SC-Leu-Trp平板上，30C培养2天。表3-2酵母转化组合Table3-2SetsofplasmidsusedinyeasttransformationassayLEU2PlasmidTRPIPlasmidPurpose1nonenoneNegativetransformationcontrol2pEXP?32/Krev1pEXP?22/RalGDS-wtStrongpositiveinteractioncontrol3pEXP?32/Krev1pEXP?22/RalGDS-m1Weakpositiveinteractioncontrol4pEXP?32/Krev1pEXP?22/RalGDS-m2Negativeinteractioncontrol5pDEST?32pDEST?22Negativeself-activationcontrol6BaitplasmidpDEST?22Testofself-activation2.1.1.4自激活检测转化完成后，可以进行诱饵载体的自激活检测，同时确定文库筛选时的3AT浓度，具体步骤如下：从SC-Leu-Trp平板上挑取4个包含重组诱饵载体和pDEST?22载体的单克隆，在一个新的SC-Leu-Trp分别划线，同时，分别挑取表3-2中组合1到5的2个单克隆作为对照，30C培养18h；将SC-Leu-Trp作为样板影印至包含不同3AT浓度(0mM,10mM,25mM,50mM,75mM,和100mM)的SC-Leu-Trp-His平板上，迅速进行影印清洁2-3次，30°C培养24h；24h后，再次进行影印清洁2-3次，然后继续放于30C培养约2天(40-44h)后，进行观察，可以抑制包含重组诱饵载体和空猎物载体的酵母细胞生长的最低3AT浓度即为筛库时所用的3AT浓度，如果这个浓度为100mM，则表明诱饵载体本身存在自激活作用，筛库不能进行，若低于100mM，则筛库可以进行。2.1.1.5文库筛选进行文库筛选之前，需将重组诱饵载体按照中的转化方法转AMaV203中，在SC-Leu平板上筛选阳性克隆。然后进行文库筛选级别的酵母感受态细胞制备，制备过程如下：接种含有诱饵载体的酵胃菌于20mLSC-Leu培养基中，30C过夜培养；翌日早上，将培养液加入300mLSC-Leu液体培养基中至浓度为2x106cells/mL(OD6妒〜0.10)，30C继续培养直至培养液浓度达到2x107cells/mL(OD600=〜0.50)；室温1000-1500xg离心5分钟收集菌体，30mL无菌水重悬后转移至50mL离心管中；1000-1500xg室温离心5分钟，弃上清，加入1.5mL1xTE/1xLiAc重悬；立即将感受态细胞用于转化。将文库转化入酵母感受态细胞的步骤如下：加川g及库DNA和50曜高质量鲑鱼精DNA至每个1.5mL离心管中，共加30个管，每个管里加入50四L重悬的酵胃感受态细胞。注意：及库DNA和鲑鱼精DNA的总体积不能超过20四L，最好不超过10四L；加300由除菌的40%PEG-3350/1xLiAc/1xTE至每个离心管中，翻转离心管充分混合，30C孵育30min；加DMSO到10%(〜40四L每管)，然后翻转混匀，42C热击10min；从一个转化管中取出100四L转化液，用灭菌生理盐水按照1:100和1:1000进行稀释，每个稀释倍数涂100四L至10-沔的SC-Leu-Trp中^子上；将30个管中的转化产物分别涂到30个15-cm含有合适的3ATffiSC-Leu-Trp-His平板上，30C培养3天；计算10-cmSC-Leu-Trp板子上的克隆数，最好平板上长有20到300个克隆，通过下面的公式计算转化效率：每个转化反应的克隆数=单个平板上的克隆数x稀释倍数x转化总体积/单个平板上涂的菌液体积；对每个SC-Leu-Trp-His+3AT平板进行影印清洁；30C继续培养2-3天后，初步筛选出阳性的His+克隆。2.1.1.6报告基因检测将SC-Leu-Trp-His+3AT^板上长出来的His+克隆子以及中的转化组合2-6重培养的新鲜菌落，用无菌水稀释到同一浓度(一个直径1mm菌落加入30四L无菌水中，用血球计数板将所有稀释液调整至同一浓度)。检测HIS3基因和URA3基因表达情况时，将每个菌落稀释液吸取 3四L点至SC-Leu-Trp-His+3AT，SC-Leu-Trp-Ura以及SC-Leu-Trp+5FOA(0.2%)平板上，30C培养3-5天。检测lacZ基因表达情况时，吸取3四L每个菌落的稀释液点至YPAD(覆盖NC膜)平板上，30C培养2精心整理天，准备进行X-gal实验。X-gal实验的步骤如下：称取10mgX-gal溶解在100四LDMF中，溶解后加入10mL的Zbuffe4,同时加入60四邙-疏基乙醇，混匀备用；将两张直径125-mm的Whatman541滤纸叠放在直径15-cm的培养皿中，用约8mL的上述X-gal溶液完全浸润，并将气泡移除；用镊子将YPAD平板表面的带有菌落的NC膜轻轻取出，完全浸润在液氮中20-30S，然后将冻过的NC膜轻轻放在上述准备好的滤纸上面，移除气泡，然后轻轻将培养皿中多余的液体倒出；盖上培养皿的盖子，放置于37°C孵育，孵育时将培养皿倾斜一个很小的角度，从而避免X-gal在滤