重亚硫酸盐测序操作方案

■亚硫酸盐测序操作方案一、样品收集1、 配制2%低熔点琼脂糖称取0.02g低熔点琼脂糖，倒入1.5mL离心管中，随后加入1mLmPBS溶液，置于100°C金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4^保存待用。2、 收集细胞样品80C以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。向1.5mL离心管底部加入8险低熔点琼脂糖，避免产生气泡。迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500"L矿物质油覆盖。最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20X保存待用。二亚硫酸氢盐修饰3、配制DNA细胞裂解液：向20mLTE缓冲液中加入100pL的20mg/ml蛋白酶K。4、向含样品的离心管内加入500pLDNA细胞裂解液，50X金属浴8h以上，以消化样品。5、在上一步消化进行的同时配制转化液，注意避光亚硫酸氢钠4.75g双蒸水4.5mL2MNaOH3.5mL对苯二酚0.138g共计10mL6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性:0.3MNaOH,500pL,15min,2次；0.1MNaOH,1mL,5min,1次。7、换液加入500pL转化液，50X金属浴8h以上，以转化样品，注意避光。8、用TEft冲液中止转化，1mL,15min,6次。9、用0.2MNaOH脱磺化，500pL,15min,2次。10、 用TE^冲液中止脱磺化，1mL,15min,3次。11、 用双蒸水清洗，1mL,10min,2次。12、 清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200口1离心管中，-20C保存待用。甲基化基因的PCR

13、使用设计好的两对甲基化特异性引物对转化后的DNA样品进行巢式PCR反应。步骤预变性变性退火延伸终延伸降温温度94C94C55~65C72C72C4C时间2min30s30s30s2min8第一轮反应体系25陀，转化后琼脂糖小球计为2pLDNA。第二轮反应体系扩大为50rLo试剂25pL反应体系50pL反应体系2xTaqMasterMix12.525RNase-FreeWater8.519ForwardPrimer,10pM12ReversePrimer,10pM12TemplateDNA2214、将第二轮反应产物全量加入胶孔中，跑胶时尽量跑完全程以分离杂带。在紫外灯下找到目的条带，快速精确切取，将胶块放入1.5mL离心管内。15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1g=100叽）QGBuffer,50°C金属浴至胶融化，同批样品可统一为450pL,以便于离心。16、加入116、加入1倍胶体积（150pL）异丙，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心,13000g,1min。17、 倒掉收集管内液体，向离心柱内加入500叽QGBuffer，再次离心，13000g,1min。18、 倒掉收集管内液体，加入750pLPEBuffer，静置2min，再次离心，13000g,1min。19、 更换收集管再次离心，13000g,1min,倒置离心柱在滤纸上晾干2min，再插入新收集管。20、 将25pLEBBuffer精确加至离心柱中心内膜，静置3min后离心，18000g,10min。21、 取少量收集管内DNA溶液检测样品浓度（分光光度计或跑胶检测），余下-20C保存待用。微'■分光光度计：测定DNA浓度并记录，连接微'■分光光度计：测定DNA浓度并记录，连接T载体时稀释各组至合适的统•浓度。,跑胶：取5pLDNA^S与1pL6xloadingbuffer混合，点样跑胶检测目的条带，依据目的条带亮度决定连接T载体时的DNA上样量。（亮1pL;中等2pL;弱3pL）五、克隆测序22、预先制冰，将pMD18-TVectorCloningKit冰上解冻，依次向200口1离心管内添加:高DNA浓度中DNA浓度低DNA浓度

双蒸水3pL2pL1pL共计5pL1pL顼pLpL1pL3pL混匀后，加入5pLSolutionI;再次混匀，放入PCR仪中16°C连接8h。T«体

DNAWS23、在上一步连接进行的同时，配制LB/AMP培ffS(1)配制LB液体培^S(200T«体

DNAWS1%(w/v)Tryptone2g0.5%(w/v)YeastExtract1g1%(w/v)NaCl2g固定容后，加入200pL2MNaOH将pH值调至7.0，混匀后移入玻璃瓶内。(2)配制LB固体培^S(200mL)再配制200mLLB液体培养基，随后倒入含3g琼脂粉的烧杯中，(3)将两种培养基与玻璃棒、涂板小杆等一同高压灭菌。(4)高压后冷却至40~50C时，向200mLLB固体培养基内加入200pL100mg/mLAmpicillin,向150mLLB液体培养基内加入150pL100mg/mLAmpicillin剩余50mL不加Ampicillin。(5)摇匀LB固体培养S，取90mm培养皿分装，每盘内倒入约20mL。(6)待培养基凝固后，进行涂板。每板加入50pL20mg/mLX-Gal与20pL50mg/mLIPTG,混合后涂抹均匀，避光晾干备用。24、转化感受肽(1)连接完成后，将10pL样品全量加入含100pLDH5a感受态细胞的1.5mL离心管内。(2)轻轻混匀后冰上放置30min,42^金属浴激发90s,冰上冷却2min,操作时避免剧烈晃动。(3)加入900pL不含Ampicillin的LB液体培WS，放入摇床，37C,150g,培养1h以上。25、养菌待摇床上离心管内菌液长好(充满液体)，取100pL菌液滴入凝固的培养基并涂抹均匀。将涂板倒置在摇床内，37V,避光，保湿，避风，培养12h以上，待菌斑长至直径1mm左右。此时培养基上白斑可用，蓝斑淘汰。可将培养基直接封口，送样测序，也可进一步挑菌培养。

26、挑菌用枪头挑取单个阳性克隆菌落混入加有1mL含Ampicillin的