植物叶片中dna提取方法的改进

植物叶片中dna提取方法的改进

1dna的提取技术在长寿史上，一些著名的实验证明了生命遗产的性质是dna。Griffith用肺炎双球菌对小鼠进行活体实验,为发现DNA是遗传物质打下了坚实基础;Oswald领导的一个研究小组所作细菌转化实验,基本上否定了一直以来认为蛋白质是遗传物质的观点;在此基础上,Hershey确定出DNA分子就是生命的遗传物质。至此,生命科学研究进入一个崭新的研究时代——DNA时代。为了进一步认识和了解DNA的本质和特征,研究人员摸索出多种分离提取DNA的方法,如氯化铯法、SDS法和一管法等,并在动、植物和微生物的DNA研究中运用。由于这些DNA提取方法有的成本高和使用会造成环境污染的化学诱变剂溴化乙淀,有的不稳定和效果不够理想。我校本科教学实验中难以开出这样的实验。随着这一技术逐步改进,如Saghai-Maroof等研发出十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法用于提取植物DNA等,使得DNA的提取相对较为快捷,提取的质量提高。近几年来随着我校对实验设备大量投入,一批适合于现代生命科学教学和研究需要的仪器和设备能够满足要求。在众多的DNA提取方法中,发现CTAB法是一种较为理想的提取植物DNA的方法。根据我院实验室仪器设备的具体情况,我们多次使用CTAB法后发现,这种方法还可以进一步的改进和完善。在多次指导学生开展教学和研究活动过程中,总结出一种适合于我院学生学习和开展研究活动的、操作简便且效果好的DNA提取方法,该方法可以使学生在较短时间获得理想的实验效果,除了能直接观察到DNA的丝状沉淀外,在琼脂糖电泳中还可确定出所提取DNA分子的大小。2多聚糖以外的多聚糖的提取利用CTAB在高离子强度的缓冲溶液中与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物,但不沉淀核酸的特性,用离心获得含DNA的上清液;用氯仿和异戊醇混合液使蛋白质变性、分层,同时除去脂类的方法,从而达到提取和纯化DNA的目的。3设备和主要化学试剂3.1设备实验所需仪器设备较为简单,主要有研钵、离心机、水浴锅、天秤、灭菌锅、移液枪和电泳仪等。3.2化学试剂和用品主要有NaCl、EDTA、Tris、HCl、CTAB、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇和液氮等。3.3dna提取缓冲液根据CTAB提取DNA的原理,配制如表1所示的DNA提取缓冲液。需要注意的是,CTAB和β-巯基乙醇不能进行高温灭菌,因此,在配制提取缓冲液之前应将其他成分进行高温灭菌,之后加入这2项试剂。4样品的提取和分析一般以鲜嫩的植物叶片为宜,其中以随收集随提取最佳;如不能做到,则应及时贮藏在液氮中或-20℃的冰箱中尽快提取。在开展DNA提取工作前,需要完成4方面的准备工作:①水浴锅温度升至65℃;②将提取缓冲液置于水浴锅中预热;③在冰箱中预冷异丙醇和24∶1的氯仿∶异戊醇混合液;④学生2人一组,每组分有1.5、2mL无菌离心管各1支,并作好标记。之后可按下列操作步骤和注意事项进行。(1)称取0.5～1.0g的植物幼嫩叶片,搁置于研钵中,加入约30mL的液氮,轻轻捣碎叶片,等液氮快挥发完时,快速研磨到粉状(越细越好),把粉末转移到有标记的2mL无菌离心管中。此步操作应戴手套,防止皮肤冻伤。(2)加入650μL预热的DNA提取缓冲液,用力振荡1～2min,马上放入65℃水浴锅中保温45min以上,其间,每隔15min用手轻微振荡3或4次。(3)从水浴锅中取出样品管,加入650μL预冷的24∶1的氯仿∶异戊醇,盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5～10min。(4)在10000r/min下离心10min。(5)用移液枪缓慢吸取上层清液约500～700μL到做好标记的1.5mL离心管中。此步操作应非常小心,注意不要吸得过多、过快,避免振荡,以免造成蛋白质污染;如果离心层因振荡引起上清液浑浊,将影响提取效果,此时须要再离心。(6)在获得的上清液中加入预冷的异丙醇,加入量按吸取上清液体积的2/3计,约330～470μL。轻轻上下摇动离心管,注意观察DNA将从溶液中析出。如溶液中DNA含量较少,将会观察到管中含有白色悬浮的DNA颗粒;如样品中DNA含量较高,则可观察到白色絮丝状的DNA悬浮于溶液中。(7)此步可根据学时数灵活掌握。或静置此样品于4℃冰箱1h,或过夜,或马上在8000r/min条件下离心5min,继续提取DNA。(8)离心后,小心倒掉上清液,用纸吸去管壁处多余的溶液,保留DNA沉淀于管底。(9)加入70%乙醇600μL洗涤沉淀,振荡起沉淀数秒钟,5000r/min条件下离心去上清液。再重复步骤(9)洗涤沉淀1次。(10)室温下干燥DNA沉淀,在见到无色胶状物附在管壁时,加入80μL无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。(11)此步用于要求较高的科研中。一般来讲,RNA不影响DNA特性的分析,如想获得不含RNA的DNA样品,在提取获得的DNA样品管中加入2μLRNase,就可得到高质量的DNA样品。(12)得到的样品于冰箱-20℃保存备用。(13)采用紫外分光光度计法检测DNA的含量,检测260、280nm处的OD值,计算得出DNA的含量。如OD260/OD280=1.8左右,DNA较为纯净;<1.8,则有蛋白污染;>1.8,则有RNA污染。同时,还可进一步用1%的琼脂糖电泳检测DNA的质量,以得到非常直观的效果。图1是提取DNA样品的电泳图,表明获得的DNA有较高的质量。5dna的提取高质量的DNA是进行植物分子生物学研究的基础。由于植物组织,如叶片中含有较高的多酚、蛋白质、脂类、多酯的角质等不利于DNA提取的干扰物质,利用常规的CTAB方法等难以获得高质量DNA。究其原因,主要是提取所得的DNA样品中含有较高含量的蛋白质,甚至具有多酚氧化的褐色物等,从而影响利用DNA进行进一步的特性分析(如酶切,PCR反应等)。针对这种情况,根据我们的实验条件和多年来在提取植物DNA技术上的经验,对CTAB法进行了如下改进:①尽量随采随收幼嫩的植物组织作为提取DNA的材料;②采集的样品及时放入液氮中,减少植物组织中DNA的降解;③对较老的植物组织,适当加大β-巯基乙醇的用量(可达2.5%～3%),减少组织的褐变;④减少在DNA提取步骤(5)中吸取上清液的量,避免蛋白质污染;⑤去除样品中残留的RNA。在提取获得的DNA样品中加入RNase,就可得到高质量的DNA样品;⑥对DNA提取的各项操作步骤进行了